Штамм бактерий bacillus coagulans продуцент рестриктазы всо ai

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 18 НИЯ БРЕТ САНИЕ вают при аэрации в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, до поздней логарифмической фазы роста, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами, Биомасса В.соацо 1 апз ВКМ Всодержит новую сайт-специфическую эндонуклеазу ВсоА 1, узнающую и расщепляющую последовательность ДН К 5 С-А-Сф О-Т-О 3, в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных количествах, содержание рестриктазы ВсоА 1 в биомассе 6000 - 8000 ед/г сырой биомассы. Для изошизомера ВсоА 1, рестриктазы РваС 1, выходочищенного фермента 20 ед на 1 г сырого веса биомассы. Выход очищенного препарата эндонуклеазы рестрикции ВсоА составляет 700-1 200 ед. активности на 1 г сырой биомассы, что в 35 - 60 раз превышает известные цифры для рестриктазы РваС 1. Эндонуклеаза рестрикции ВсоА 1 не содержит примесей фосфатаз, экзонуклеаз и неспецифических эндонуклеаз. време более х Рва сорЫ а ДНК ф 10 и н а ЯЧ 40 естриктазы РгпаС в биоа выход очищенного пресоставляет около 20 ед биомассы.тения является получение продуцирующего новую ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ. СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Институт биологической и медицинскойхимии АМН СССР и Институт молекулярнойбиологии им. В.А.Энгельрардта(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ВАС 103СОА 601 АМЯ - ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ ВСО А 1(57) Использование: биотехнология и в практике молекулярно-генетических и генноинженерных работ. Сущность изобретения:продуцент В,соацц 1 апз ВКМ ВвыращиИзобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в молекулярно-генетических и генноинженерных работах.Сайт-специфические эндонуклеазы (синонимы; рестриктазы 11 класса, эндонуклеаэы рестрикции) нашли широкое применение в качестве уникального инструмента исследования в молекулярном клонировании, структурных исследованиях ДНК, разработке подходов к диагностике наследственных заболеваний у человека, являются удобной моделью для изучения механизмов ДНК- белковых взаимодействий,9) (11)ц 5 С 12 й 9/16, 1/ К настоящему охарактеризовано одна из которь Рзеобовопаз ва мент гидролизует аденовируса Аб 2 в обезьяннего вирус плазмиду рВВ 322Содержание р массе не указано, парата фермента активности на 1 гЦелью изобре штамма бактерий ни обнаружено и СО 1300 рестриктаз, С) С 1 выделена из Дь СВ 50 Р /1/. Ферага А а 3 участках, е расщепляет ДНК ДНК фага 4 Х 174 ирестриктазу ВсоА со специфичностью 5С-А-С О-Т 3 с высоким выходом фермента,Поставленная задача достигается тем, что биомассу В,соаооапз ВКМ Ввыращивают при аэрации в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, до поздней логарифмической фазы роста, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами,Рестриктаза ВсоА - изошизомер РтаС, узнает и расщепляет участок нуклеотидной последовательности ДН К 5 .С-АС 6-Т, 3. Фермент гидролизует ДНК фага А по 3 участкам, ДНК аденовируса АО 2 по 10 и не имеет сайтов узнавания на ДНК обезъяннего вируса ЯЧ 40, ДНК фагаФ Х 174 и плазмиде рВЯ 322,Поиск штамма продуцента проводили с использованием толуольного экспресс-метода тестирования рестриктазной активности в клетках микроорганизмов с последующим электрофоретическим разделением продуктов гидролиза ДНК в геле агарозы. Всего обследовано 48 штаммов, относящихся к родам Васцз,Штамм В.соаоцапз ВКМ Вполучен из Всесоюзной Коллекции Микроорганизмов АН СССР, где хранится под М ВКМ В- ССМ 101=РОО 3557,Характеристика штамма,Морфологические особенности, Клетки палочковидные, прямые или почти прямые, подвижны, образуют споры, Грамположительные,Культурально-биохимические свойства. На скошенном агаре рост по штриху обильный, На чашках Петри с мясо-пептонным агаром колонии крупные, матовые, На мясопептонном бульоне и бульоне Хоттингера равномерное помутнение, осадок,отношение к кислороду - строгий аэроб, Каталаза +,Индол -,На глюкозе - кислота+, газ - ,Желатина уколом - разжижение, Оптимальные условия выращивания и хранения культуры.Культура Васцз соациапз ВКМ Вхорошо растет на твердых и жидких полноценных питательных средах: мясо-пептонном бульоне, среде В, бульоне Хоттингера.Оптимальные значения температуры и рН роста культуры находятся при 37 С и рН7,2-7,4.Наибольший выход биомассы, содержащей рестриктазу ВсоА, достигается при выращивании штамма-продуцента в 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ферментере при 37 С в аэробных условияхна питательной среде Хоттингера, котораясодержит в 1 л, 250 мл основного перевараХоттингера; 5 г КаС; 1 г К 2 НР 04 и до 1 лводы. Выращивание прекращают в концелогарифмической фазы роста, когда ростдостигает Аббе=1,5 - 1,7, Выход биомассы 7 - 8г/л,На рыбной среде культура растет плохо(при 18-часовой ферментации на качалкеА 650=0,3).Ферментацию культуры проводят последобавления в ферментер инокулята в соотношении 1:10 к объему среды.Рабочие культуры пересевают на мясопептонный бульон или среду Хоттингераодин раз в 8-10 дней,Хранят культуру в полужидком мясопептонном агаре под вазелиновым масломили в лиофилизированном виде в ампулах,Выделение рестриктазы ВсоА проводятфракционированием бесклеточных экстрактов двухфазной системе полиэтиленгликоль/декстран и хроматографией на колонкахс ионообменниками.Инкубационная смесь для определенияактивности рестриктазы ВсоА объемом 30 -50 мкл содержит: 0,01 М трис-НС буфер, рН7,5, 0,01 М МцС 2, 0,1 М МаС, 0001 М дитиотреитола, 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, 1 мкг ДНК фага Л и 0,2-2мкл фермента, Инкубацию проводят при 37С в течение 60 мин, Продукты расщепленияДНК фага А анализируют электрофоретически в 0,8 - 1, агарозном геле с последующим прокрашиванием геля в бромистомэтидии, За единицу активности рестриктазыВсоА принимают количество фермента (вмкл), которое за 1 ч инкубации полностьюгидролизует 1 мкг ДНК фага Л при оптимальных условиях реакции,П р и м е р 1, Культуру В,соаццапз ВКМВпредварительно адаптируют в течение ночи при 37 С в условиях аэрации наосновной питательной среде, содержащей в1 л: 250 мл основного перевара Хоттингера:5 г МаС; 1 г К 2 НРОд; до 1 л Н 20. Инокулятдля посева в ферментер готовят, пересеваяадаптированную культуру на 1 л свежей среды из расчета 1:10 и размножают в условияхаэрации,Ферментацию культуры проводят последобавления в среду инокулята в соотношении 1;10 к объему среды в условиях аэрациипри температуре 37 С, рН среды 7,2 - 7,4.Во время выращивания рН культуральной жидкости поддерживают в пределах7,0-7,6.1761804 П р и м е р 2. Культивирование штамма В,саадиапз ВКМ Впроводят аналогично описанному в примере 1, за исключением того, что в качестве питательной среды используют средуВ, которая содержит в 1 Составитель И,ПриваловаРедактор В.Тоубченко Техред М.Моргентал Корректор Л,Ливринц Заказ 3235 Тираж Подписчое ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина. 101 Выращивание продолжают до достижения конца логарифмической фазы роста.Выход сырой биомассы составляет 7 - 8 г/л культуральной жидкости,Содержание рестриктазы ВсоА в биомассе составляет 6000 в 80 ед/г микробной массы,Выделение рестриктазы ВсоА10 г биомассы В.соадШапз ВКМ Всуспендируют в буферном растворе, клетки разрушают ул ьтразвуком при температуре + 2-4 С и клеточную суспензию центрифугируют в течение 60 минут при 105 000 д, Осадок, содержащий клеточные оболочки и неразрушенные клетки, отбрасывают, а присутствующий в супернатанте фермент фракционируют в двухфазной системе полиэтиленгликоль/декстран, Обогащенную по рестриктазе ВсоА верхнюю фазу хроматографируют в калий-фосфатном буфере в градиенте концентрации КС на колонках с ДЭАЭ-сефарозой С:6 В и с фосфоцеллюлозой Р,Получают 12000 ед, активности фермента в 2 мл буфера с 50 глицерином, Выхрд очищенного препарата рестриктазы ВсоА составляет 1200 ед на 1 г сырого веса биомассы, Препарат фермента стабильно сохраняет активность в течение 9 - 12 месяцев при хранении при -20 С.Фермент не содержит примесей фосфатаз, экзонуклеаз и неспецифических эндонуклеаз и пригоден для молекулярного клонирования и изучения структуры ДНК,л; 10 г триптона; 10 г дрожжевого экстракта;10 г йаС; до 1 л воды,Выход биомассы 5-6 г/л культуральнойжидкости.5 После проведения очистки фермента, какописано выше, выход рестриктазы ВсоА составляет 700 - 900 ед, активности/г сырого веса биомассы,Таким образом, по предлагаемому спо 10 собу получают новую эндонуклеазу рестрикции ВСОА.Биомасса штамма В,соадцапз ВКМ В содержит новую сайт-специфическую эндонуклеазу ВсоА, узнающую и расщепляющую15 нуклеотидную последовательность ДНК 5С-А-С 6-Т 3 в количествах, достаточныхдля получения рестриктазы в препаративныхмасштабах: содержание рестриктазы ВсоА вбиомассе 6000 - 8000 ед/г,20 Выход очищенной рестриктазы РтаС,изошизомера ВсоА, 20 ед/г микробной массы.Для рестриктгзы БсоА выход очищенного фермента составляет 700 - 1200 ед ак 25 тивности на 1 г сырой биомассы, что в 35 - 60раз превышает указанные цифры для рестриктазы РгпаС (50 ед),Эндонуклеаза рестрикции БсоА не сгдержит примесей фосфатаз и неспецифиче 30 ских нуклеаз.Учитывая особенности строения участка узнавания рестриктазы ВсоА и его локализации на векторных молекулах ДНК,новый фермент может быть использован е35 молекулярно-генетических и биотехнологических работах,Формула изобретенияШтамм бактерий Васцз соаддапяВКМ В- продуцент рестриктазы Всо А.