Штамм бактерий bacillus alvei продуцент рестриктазы bav в ii

, 1/20 1)5 С 12 ОБРЕТЕН ОПИСА А НЕ -ивмо- енноинщность М Вв питаки углеГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Институт биологической и медицинской химии АМН СССР(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ВАСОЯ ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ ВА 1/В (57) Использование: биотехнология лекулярно-генетических работах и г женерных исследованиях. Су изобретения: биомассу В аче ВК выращивают в аэробных условиях тельной среде, содержащей источни Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в молекулярно-генетических работах и генно- инженерных исследованиях.РестриктазыКласса(синонимы: эндонуклеазы рестрикции, сайт-специфические эндонуклеазы), осуществляющие расщепление фосфодиэфирных связей ДНК по специфическим нуклеотидным последовательностям (сайтам), являются незаменимым инструментом исследования в практике молекулярно-генетических и. генно-инженерных работ, представляют собой уникальный объект для изучения природы и механизмов белково-нуклеиновых взаимодействий. Этими обстоятельствами и объясняется огромный интерес рода, азота и минеральные соли до поздней логарифмической фазы роста, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами, Биомасса штамма бактерий В.аче ВКМ Всодержит новую эндонуклеазу рестрикции Вач В , узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность ДНК 50 СМСС , 3, в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах: содержание 4 оестриктазы Вач В в биомассе 3 - 4 х 10 ед/г сырой микробной массы. Для рестриктазы Аэц , изошизомера эндонуклеазы рестрикции Вач В, содержание фермента в биомассе и выход очищенного препарата фермента не указаны, Выход очищенного препарата рестриктазы Вач В составляет 8 - 12 х 10 ед на 1 г сырой3биомассы, Рестриктазы Вач В не содержит примесей фосфатаз, неспецифических эндонуклеаз и экзонуклеаз,исследователеи в области биохимии, моле кулярной биологии, микробиологии, вирусо- д логии к выявлению продуцентов новых 00 рестриктаз, разработке способов их очист- С) ки, изучению свойств, использованию в мо- ( 1 лекулярно-генетических экспериментах,Рестриктазы выделены и частично или полностью охарактеризованы из более чем 1100 микроорганизмов самых различных таксонов /1/, Одна из рестриктаз, Азц, выделена из штамма АпаЬаепа эцЬсупегса ССАР 1403/4 В /2/,Эндонуклеаза рестрикции Азц расщепляет ДНК фага А в 74 участках, ДНК аденовируса Ас 2 в 164, ДНК обезьяннего вируса ЯЧ 40 в , ДНК фагаХ 174 в 2 и плазмидуКультурально-биохимические свойства На скошенном агаре - слабый, нежный налет, Колонии на МПА очень мелкие, блестящие, выпуклые с ровными краями,На мясо-пептонном бульоне и бульоне Хоттин гера - заметное равномерное помутнение, сероватая нежная пленка.Отношение к кислороду - аэроб.Каталаза - образует,рВК 322 в 15, Фермент гидролизует участок нуклеотидной последовательности ДНК 5 , ООМСС .3.Содержание рестриктазы Азы в биомассе АпаЬаепа зцЬсу 1 пс 1 г 1 са ССАР 1403/4 В и выход очищенного от примесей неспецифических нуклеаз фермента не приводятся,Целью изобретения является получение штамма бактерий, продуцирующих с высоким выходом новую рестриктазу Вач В 11, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5 , Оф СКСС , 3,Поставленная задача достигается тем, что биомассу В,а 1 че 1 ВКМ Ввыращивают в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли до поздней логарифмической фазы роста, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами,Рестриктаза Вач В 11, изошизомер Ази, узнает и гидролизует участок нуклеотидной последовательности ДНК 5 , 6 6 МСС3. Эндонуклеаза рестрикции Вач В 1 расщепляет ДНК фага Л по 74 участкам, ДНК аденовируса АО 2 по 164, ДНК обезьяннего вируса ЯЧ 40 по 11, ДНК фагафХ 174 по 2 и плазмиду рВВ 322 по 15,Поиск штамма-продуцента проводили с использованием экспресс-метода определения сайт-специфической энедонуклеазной активности в толуольных лизатах микробных клеток с последующим электрофоретическим разделением в агарозном геле продуктов расщепления ДНК фага Л. Всего обследовано 18 штаммов Вас 1 Ьз а 1 че 1,Штамм В.а 1 че ВКМ Вполучен из Всесоюзной коллекции микроорганизмов АН СССР, где хранится под 1 ч. ВКМ ВМС 1 В 8199 Мйй В Характеристика штаммаМорфологические особенности, Палочковидные клетки, прямые или почти прямые, размером 0,5-0,8 х 2 - 5 мкм, подвижные (признак варьирует), Расположены поодиночке и парами, образуют споры. Грамположительны (признак непостоянный, варьирует Гр - Гр).+ 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Утилизация углеводов - на глюкозе, лактозе, сахарозе образуют кислоту; на арабинозе, ксилозе и манните кислоту необразуют,Крахмал - гидрол изуют.Лакмусовое молоко - свертывание, пептонизация,Индол и диоксиацетон - образуют,Казеин - расщепляют,Тирозин - не расщепляют,Фенилаланин - не дезаминируют.Оптимальные условия выращивания ихранения культуры,Культура В.а 1 че ВКМ Вхорошо растет на жидких и твердых полноценных питательных средах - бульоне Хоттингера, среде1 В,мясопептонном бульоне,Максимальная и минимальная температура роста культуры соответственно 35 - 45С и 15 - 20 С, а оптимальная температура -37 С. Оптимум роста рН 7,0 - 7 - 2, При рН10 культ,ра не растет.Наибольший выход биомассы, содержащей рестриктазу Вач В 11, получают в томслучае, когда штамм-продуцент выращивают при 37 С в аэробных условиях в ферментере на питательной среде Хоттингера,которая содержит в 1 л: 250 мл основногоперевара Хоттингера; 10 г МаС 1; 1 г К 2 НРО 4;Н 20 до 1 л, Выращивание прекращают через 3 - 4 в конце логарифмической фазы роста, ко гда рост до сти га ет А 650=1,3 - 1,5.Выход биомассы 6,5 - 8,5 г/л, На среде "рыбный экстракт" (на основе гидролизата кильки) культура растет медленно, а накоплениеактивности рестриктазы в 3 - 4 раза ниже,чем при культивировании на средах 1.В илиХоттингера.Ферментацию культуры проводят последобавления в ферментер инокулята в соотношении 1:10 к объему среды.Рабочие культуры пересевают на мясопептонный бульон или бульон Хоттингераодин раз в 7 - 10 дней,Хранят культуру а полужидком мясопептонном агаре под вазелиновым масломв лиофилизированном виде в ампулах,Культура непатогенна для мышей,Выделение рестриктазы Вач В 11 проводят фракционированием бесклеточных экстрактов изопропанолом и хроматографиейна ионообменнике и аффинном сорбенте,Инкубационная смесь для определенияактивности рестриктазы Вач В 11, обьемом30 - 50 мкл, содержит: 0,01 М трис-НС 1 буфер, рН 7,5, 0,01 М М 9 С 12, 0,001 М дитиотреитола (или 0,007 М 2-меркаптоэтанола),100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, 1 мкг ДНК фага Л и 0,1 - 1,0 мкл фермента. Инкубацию проводят при 37 С в1761803 Составитель И.ПриваловаРедактор В.Трубченко Техред М,Моргентал Корректор Л.Ливринц Заказ 3235 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород ул, Гагарина, 101 течение 60 мин. Продукты расщепленияДНК фагал анализируют электрофоретически в 0,8 - 1; агарозном геле с последующим прокрашиванием геля в бромистомэтидии, За единицу активности рестриктаэы 5Вач В 11 принимают количество фермента (вмкл), которое за 1 ч инкубации полностьюгидролизует 1 мкг ДН К фага при оптимальных условиях реакции.П р и м е р 1. Культура В.а 1 че 1 В КМ В10предварительно адаптируют на основнойпитательной среде, содержащей в 1 л; 250мл перевара Хоттингера; 10 г МаС 1; 1 гК 2 НРО 4 до 1 л воды,Инокулят для ферментера готовят, пересевая адаптированную культуру на 1 лсвежей среды из расчета 1:10 и размножаютв условиях аэрации.Выращивание культуры проводят последобавления в ферментер инокулята в состношении 1:10 к объему при температуре 37С в аэробных условиях (1 л воздуха на 1 лпитательной среды), рН среды 7,0, Во времявыращивания рН культуральной жидкостиподдерживают в интервале рН 7,2 - 7,5, 25Выращивание продолжают до достижения конца логарифмической фазы роста,Выход сырой биомассы составляет 6,5 -8,5 г/л культуральной жидкости.Содержание рестриктазы Вач В 1 - 4 х 3010 ед/г биомассы.Выделение рестриктазы Вач В 1110 г биомассы Вас 111 из а 1 че ВКМ В суспендируют в буферном растворе и клетки разрушают ультразвуком при +2 - 4 С. 35Остатки клеточных оболочек и неразрушенные клетки удаляют ультрацентрифугированием, а бесклетсчный экстракт фракционируют изопропанолом, Обогащенный рестриктазой материал хроматографируют в калий-фосфатном буфере в градиенте КС 1 на колонке с ДЭАЭ-целл юлоэой ОЕ, а затем на колонке с голубой сефарозой С 1:6 В,Получают 12 х 10 ед активности ре 4стриктазы Вач 11 в 10 мл буфера с 50; глицерином, Выход очищенного препарата фермента 12 х 10 ед активности на 1 г сырого веса биомассы, Препарат рестриктазы Вач В 11 стабилен при хранении в течение 8-10 месяцев при температуре - 20 С.Препарат фермента не содержит примесей фосфатаз, неспецифических эндонуклеаз и экзонуклеаз и пригоден для структурных исследований ДНК и генно-инженерных работ,П р и м е р 2. Культивирование штамма Вас 111 оз а 1 че В КМ Впроводят аналогичноно описанному в примсре 1 за исключением того, что в качестве питательнои среды используют среду В, которая содержит в 1 л: 10 г триптона; 5 г дрожжевого экстракта; 5 г МаС 1; до 1 л воды.Выход биомассы 6-7 г/л культуральной жидкости,Содержание ресриктазы Вач В 13 х 104 едlг микробной массь.После проведения очистки, как описано выше, выход рестриктаэы Вач Всоставляет 8 х 10 ед активности/г сырого веса биомассы,Таким образом, по предложенному способу получают новую оестриктазу,Формула иэобретнияШтамм бактерий Вас 1 оз а 1 че ВКМ В - продуцент рестриктазы Вач В 11.