Способ получения рестриктазы т 201

(1 РИ ГКНТ СССР ЕИЗ РЕТЕН ЛЬСТВ К АВТО МУ СВИ РЕСТРИКТАЗЫ Изобретенгии и генной инчению эндонуной узнавать иность нуклеотиИзвестнытаз из микроорду Т 1 еппиз, нрестриктазыапиатсцз, вклштамма, разру ие относится женерии, в ч леазы рестр расщеплять дов РибАТС способы полк биотехнолотности к полукции. способ- оследовательх способов азу, узнаю- ательность Ру.чения рестрикносящихся к роособ получения амма Т 1 еггпцз льтивирование ассы ультразвуганизмов. от апример сп Тац 1 из шт ючающий к шение биом 1 ОСУДАРСТ ВЕ 11 ЫИ КОМИ 1 Е110 ИЗОЬРЕ ЕНИЯМ И ОТКРТИЯМ(71) Научно-исследовательский и конструкторско-технологический институт биологически активных веществ Научно-производственного обьединения "Вектор" и Институт микробиологии АН СССР(56) 1, Бато ЯНц 1 сЫпаоп СНагг 1 з 1,1, ТЬеггпозтаЬ 1 е Яе 11 цепсе вресИс епбописеаве 1 гогп ТЬегтив ас 1 цатсцз. Аос, 1)1 а 11, Асаб, 81 с, ОЯА, 1977, ч,.74, М 2, р, 542-546.2. Яа 1 о Я., Я 1 погпуа Т.Аи 1 зосЫготего 1 Та 9 1 Ьгоп Т 1 егпцв тйеггпорЬ 11 цз НВ 8. 1, В ос 1 ет, 1978, ч. 84, 1). 5, р. 1319-1321.3, Н 1 гаоа 1)1, КТа К., )аа 1 гпа Н. Рцг 11 са оп апб с 1 агас 1 егтатоп о 1 зециепсе - ЯресИ 1 с гез 1 г 1 стоп епбопис 1 еазе М 111, 1 Реггпепт. Теспа 1984, ч, 62, Мг 6, р, 583-588,4. Крамаров В.ММазанов А.Л., Смоля- нинов В.В. Выделение второй сайт-специфической эндонуклеазы из Хапйогпопа Ьоссоа и ее характеристика, - Биоорганическая химия, 1982, т. 8, 1). 2. с. 220-223,1703687 А 1 1)5 С 12 ) 9/14//(С 12 ) 9/14 С 12 й 1 01)(57) Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, в частности к получению эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов РцОАТСРу. С целью упрощения способа и повышения выхода целевого продукта в качестве продуцирующего микроорганизма используют штамм Т 1 еггт 1 цз гцЬег ВКМ ВО, а хроматографическую очистку ведут последовательно на фосфо целлюлозе и гепарин-сефарозе. Выход рестриктазы Ргц 201 Х составляет 100 ед./г биомассы. Идентична рестриктазе Х 1 о 11 и во всех генно-инженерных работах может заменить ее. ком хроматограф1. а также аналорестриктазы ТЙр 11 цз НВ 8 2,Однако использование эне позволяет получить рестрищую и расщепляющую последнуклеотидов РиСАТСру,Известны такжестриктаз, узнающихследовательность ну ическую очистку фермента гичный способ получения НВ 8 из ТЬегпиз йегп 1 оспособы получения реи расщепляющих поклеотидов РцСАТСРу, 1703687/например способ получения рестриктазы М 1 еиз МсгоЬастегца 1 очцт, включающий наработку биомассы, получение грубого экстракта, фракционирование сульфатом аммония и хроматографическую очистку фермента на трех сорбентах с выходом 300 ед./г биомассы 3.Недостатком данного способа является длительность процесса очистки фермента. Кроме того, рестриктаэа М 1 ене гидролизует ДНК, содержащую 6-метиладенин в последовательности ОАТС, т.е, является чувствительной к метилированию дат-метилазой, что требует дополнительных затрат по получению неметилированной ДНК,Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения рестриктазы ХЬоиэ ХапсЬогпопав Ьоссоа 4, Данный способ включает наработку биомассы. получение грубого экстракта с последующей хроматографической очисткой на фосфоцеллюлоэе (хроматография и рехроматография) и аминогексилсефарозе,Однако используемый в известном способе штамм - продуцент содержит еще одну рестриктазу ХЬо Г, что усложняет процесс очистки фермента, требует рехроматографии на фосфоцеллюлозе, К недостаткам данного способа также относится крайне низкий выход целевого продукта - около 100 ед,/г биомассы (4000 ед. из 30 г),Целью изобретения является упрощение процесса и повышение выхода целевого п родукта.Способ заключается в том, что используют штамм термофильной бактерии ТЬегацз гцЬег ВКМ В(ВС), продуцирующий единственную рестриктазу Тгц 201 Г с повышенным ее содержанием, Штамм культивируют на питательной среде, клетки разрушают ультразвуком и проводят очистку фермента путем хроматографий на фосфоцеллюлоэе и гепарин-сефарозе.П р и м е р, Культивирование штамма и получение биомассы.Клетки ТЬеггпцв гцЬег ВСвысевают из ампулы на твердую среду, содержащую 207 О картофельного отвара, 0,57 ь пептона и 0,02 дрожжевого экстракта, инкубируют в течение 1 сут при 60 С, затем вносят петлей в 100 мл жидкой среды того же состава и выращивают в течение 24 ч при 60 С. Полученный инокулят вносят в 2 л жидкой среды того же состава и выращивают при 60 С в течение 14 ч на качалке при 60 об/мин. После охлаждения клетки собирают центрифугированием (10 мин, 6000 об/мин), Выход сырой биомассы 1 г с 1 л среды.Получение и очистка рестриктазы Тгц 201 В,5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 2 г клеток суспендируют в 20 мл 0,02 М буфера трис-НС, рН 7,5, содержащего 10М Р-меркаптоэтанола и 0,1 О тритона Х, и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием, надосадочную жидкость наносят на 20 л фосфоцеллюлоэы Р- (И/Ьастап), уравновешенной буфером А (0,02 М К-фосфат, рН 7,5, 0,001 М Р-меркаптоэтанол,5 10 ЭДТА), затем колонку промывают буфером А до исчезновения УФ-поглощающего материала в элюате, Адсорбированный материал элюируют 240 мл градиента 0-1,0 йаС в буфере А, Объем каждой фракции 8 мл, Аликвоту иэ каждой фракции (1 мкл) инкубируют 1 ч при 60 С с 1 мкг ДН К фага Л и анализируют в геле агароэы, Фракции, расщепляющие ДНК фага л (21 - 23), объединяют, диализуют 4 ч против 2 л буфера А и наносят на колонку объемом 5 мл с гепарин-сефарозой (РЬагваса), Элюцию проводят линейным градиентом МаС 0 - 1,0 М в буфере А объемом 60 мл. Объем фракций 2 мл. Фракции (16, 17), содержагцие Тгц 201 1, объединяют и диализуют против буфера Ас 50 глицерина, Полученный препарат фермента (1 мл) имеет активность 2000 ед./мл.За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага Л в течение 1 ч при 65 С,Ферментный препарат хранится при - 20 С, Из 1 г биомассы получают 1000 ед, рестриктазы Тгц 201 ,Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Тгц 201 .Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Тгц 201 Г, проводят гидролиз ДНК фага Т 7 рестриктазами Тгц 201и ХЬопо отдельности, а также совместный гидролиз этими рестриктазами. Наблюдаемая картина полного совпадения фрагментов, полученных при гидролизе ДНК рестриктазами Тгц 201и ХЬопорознь и совместно, указывает на то, что рестриктаза Тгц 201является изошизомером ХЬо , узнает и расщепляет последовательность РцСАТСРу. Предложенный способ обладает следующими преимуществами по сравнению с известным: упрощает процесс получения целевого фермента (сокращается число стадий), обеспечивает выход целевого фермента в 8 раз выше,Поскольку рестриктаза Тгц 201 1 имеет сайт узнавания, идентичный сайту ХЬо ,1703687 она может заменить эту рестриктазу во всехгенно-инженерных работах. Сосэвитель Л ЮшковаТехред М.Моргентал Корректор Т. Малец Редактор Л, Волкова Заказ 40 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж. Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 Формула изобретенияСпособ получения рестриктаэы Тго 201 Г. включающий культивирование продуцирующего микроорганизма на питательной среде, отделение клеток и разрушение их ультразвуком с последующей постадийной хроматографической очисткой на сорбентэх - фосфоцеллюлоэе и производном сефароэы, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что с целью упрощения процесса и повышения выхода 5 целевого продукта, в качестве продуцирующего микроорганизма используют штамм ТЬеггпов гоЬег ВКМ В, а при хроматографической очистке в качестве производного сефарозы берут гепарин-сефарозу, 10