Способ очистки нуклеазы из проростков ячменя

СОГОЗ СООЕСКИХ СОИРЛИСТИЧГСКИХ РГС 1 УЬЛИК с 51)5 С 12 Г 4 9/22 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН и униМячи посеавео 09 Са511.еглатоппоотв. -р. 2057 ЗЫ И уклеазы изему гомо Г ОСУДАРСТВЕ 1 61011 КОМИТЕПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМГРИ ГКНТ СССР АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(56) 1. Яоп 9 Я,С.,аз 1 оччвЬ М,Я. А1 гогп Ьеап вргоотз, - .3 оогпа о 1 ВСегпзтгу, 1962, ч. 237, Г 4 2, р, 5062, Ргептсе ч., Незе 5. Сэагасто 1 посеаве 1 гогп Вагеу 5Рпутоспегпвтгу, 1986, ч. 25, М 9,2062,(54) СПОСОБ ОЧИСТКИ НУКЛПРОРОСТКОВ ЯЧМЕНЯ Изобретение относится к биохимии и биотехнологии и может быть использовано для ферментативного синтеза нуклеозидтрифосфатов, меченных фосфором(ЗЗ) в а-положении фосфатной группы,Известен способ получения нуклеазы, базирующийся на традиционных приемах очистки - фракционирование солями гель., ильтрация, ионообменная хроматография (1),Способ не позволяет получать препараты, отвечающие требованиям в отношении примесных активностей. так как не содержат надежного этапа их устранения (особенн о АТ Ф-а з).Наиболее близким является способ очистки нуклеазы из проростков ячменя (2). Способ включает четыре стадии очистки: сульфатаммонийное осаждение белков в интервале 4080% насыщения. ионообмен.Ж, 1703 б 88 А 1(57) Изобретение относится к биохимии и биотехнологии и может быть использовано для ферментативного синтеза нуклеоздтрифосфатов, меченных фосфором -32(33) в сс-положении фосфатной группы, Целью зобретения является увеличение выхода целевого продукта, свободного от примесных АТ-фазной, 5 -нуклеотидаэной и неспецифической фосфатазной активностей, Способ заключается в том, что проростки ячменя 4- 6 дней гомогенизируют, экстрагируют, фракционируют экстракт сульфатом аммония 40- 80, суспензию прогревают 15 мин при 60 С. хроматографируют на ДЭАЭ-целлюлозе и силохроме 50/80 красно-коричневом 2 К. Выход по активности 330, степень очистки - 426 раз. 1 э.п. ф-лы., 6 ил., 5 табл. ную хроматографию на ДЕАЕ-трис-акриле М при рН 8,0, гельфильтрацию на 0-75, афинную хроматографию на АМФ-сефярозе.К недостаткам известного способа относятся низкий выход очищенного продукта - не более 1 ь, нецелесообразность применения афинного сорбента АМФ-сефарозы для крупномасштабной очистки нуклеэзы ввиду малой емкости и нестабильности сорбента, отсутствие характеристики энзимологической чистоты препарата нуклеаза,Целью изобретения является увелчение выхода целевого продукта, свободного от примесных АТ-фазной, 5-нуклеотидазной и неспецифической фосфатазной активностей,Согласно способу очистки нпроростков ячменя, включающгенизацию сырья, сульфатаммонийное осаждение белков, ионообменную хроматографию при рН 8,0, в качестве сырья используют 4-6-дневные проростки ячменя, гомогенат из сырья подвергают очистке путем сульфатаммонийного осаждения белков в интервале 40-80 насыщения с последующим нагревом суспензии до 60-1 С в течение 15 мин, после чего проводят хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе с элюцией ферментов раствором 0,1 М чаС и псевдоафинную хроматографию на силохроме 50/80 красно-коричневом 2 К при рН 8,0 с предварительной элюцией примесных белков раствором 0,1 М МаС и элюцией нуклеазы раствором 0,5 М ИаС.На фиг.1 показана динамика изменения активности целевого и примесных ферментов в зависимости от возраста (максимальная 3-нуклеотидазная активность обнаружена в 4-6-дневных проростках, а не в 6 - 7-дневных, как в известном способе); на фиг.2 - устойчивость нуклеазы к нагреванию до 60 С в течение 15 мин (при тепловой обработке происходит частичная инактивЭ- ция примесных дефосфорилирующих ферментов 5 -нуклеотидазы и АТФ-аэы (до 60-70), отсюда целесообразность введения этого этапа в процедуру очистки); на фиг.З - профиль элюции белков с ДЕАЕ- целлюлозы (рН 8,0) при осуществлении ступенчатой элюции раствором 0,1 М МаС (на этом этапе происходит дополнительная очистки фермента в 4,1 раза, однако примесные дефосфорилирующие ферменты не отделяются от целевого фермента), на фиг.4 - профиль элюции белков при рН 8,0 с псевдоаффинного сорбента силохром 50/80 красно-коричневый 2 К при осуществлении ступенчатой элюции примесных белков раствором 0,1 М ИаС и элюции нуклеазы с 3-нуклеотидазной активностью раствором 0,5 М чаС (в этих условиях проведения хроматографии неспецифичная фосфатаза и 5 -нуклеотидаза не адсорбируется, АТФ-аза связывается слабо и полностью элюируется с 0,1 М МаС, тогда как нуклеаза связывается прочно и элюируется с 0,5 М йаС); на фиг,5 - оптимум рН 3-нуклеотидазной активности (рН 8,2); на фиг.б - диаграмма, поясняющая предлагаемый способ.Пороговые концентрации растворов МаС, примененных при хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе и силохроме красно-коричневом 2 К, а также рН буфера при хроматографии на силохроме красно-коричневом 2 К, подобраны экспериментально.Схема процедуры очистки нуклеазы Гомогенизация растительного материалачЭкстракция белков буферомОсаждение белков сульфатомаммония (40-80 насыщения)Тепловая обработка (60 С, 15 мин)Хроматография на ДЕАЕ-целлюлозе, рН 8,0 10 15 0,1 М МаСХроматография на силохромекрасно-коричневом, рН 8,0сснеадсорбиро,5 М МаС 0,1 М МаСванные белки 20 г неспецифичная фосфатаза,25 5-нуклеотидаза,часть АТФ-азной активности(диализ и ротив50-ного глицерина)П р и м е р 1. Все этапы очистки, крометепловой обработки и хроматографии на си 35 лохроме с иммобилизованным красителем,проводят при 0-4 С,Результаты выделения и очистки по этапам сведены в табл. 1, где показаны данные очистки нуклеазы с 3-нуклеотидазной40 активностью из 75 г проростков ячменя,Этап 1, Получение исходного экстракта.Зерновки ячменя (сорт "Пиркка") проращивают в кюветах 20 х 30 см на деионизованной воде в темноте при 20 С.45 4 - 6-суточные проростки отделяют от семени и корней, растирают в ступке или гомогенизируют в ножевом гомогенизаторе с0,1 М трис-НС буфером, рН 6,5, Гомогенатставят на качалку на 1 ч для полноты экст 50 ракции фермента, после чего центрифугируют 1 ч при 8000 о. осадок отделяют, асупернатант фильтруют через МгасосЬ.Концентрация белка в исходном экстракте20 - 30 мг/мл,55 Этап 2. Осаждение белков сульфагомаммония.К исходному энзимологическому экстракту медленно при непрерывном помешивании добавляют кристаллический сульфатаммония до 40 ф, насыщения (243 г/л), Оса7 Э.5885 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 док, сформировавшийся в течение 1 ч, отделяют центрифугированием при 10000 930 мин Осадок о 1 брасывают, супернатантнасыщают сульфатом аммония до 80%(561 г/л) Оставляют на 2 ч для формирования осадка,Этап 3. Тепловая обработка.Суспензио белков 40-80 насыщениясульфатом аммония подвергают нагреву до60 С в течение 15 мин, после чего охлаждают в ледяной бане 20-30 мин, Суспензиюцентрифугируют в том же режиме, Осадокрастворяют в 50 мМ трис-НС буфере, рН 8,0и подвергают диализу против 1 л этого жебуфера с трехкратной заменой буфера.Этап 4. Хроматография на ДЕАЕ-целлюлозе.Обессоленный раствор белка наносятна колонку с ДЕАЕ-целлюлозой (2,5 х 18 см)уравновешенной 50 мМ трис-НС буфером,при скорости 25 мл/ч После нанесения белка и промывки колонки буфером (100 мл)подают раствор 0.1 М Ма С для элюции фермента с 3 -нуклеотидаэной активностью(фиг.З), Фракции с 3 -нуклеотидазной активностью объединяют и диализуют против 1 л50 мМ трис-НС буфера, рН 8,0,Этап 5, Хроматография на силохроме50/80 красно-коричневом 2 К.Отдиализованный раствор белка наносят на небольшую колонку (2 х 6 см) ссилохромом красно-коричневым, уравновешенным 50 мМ трис-НС буфером, рН 8,0,при 20 С, после чего колонку промывают20 мл того же буфера для удаления неспецифичной фосфатазы и 5-нуклеотидазы, Примесные белки с АТФ-азной активностьюустраняют раствором 0,1 М йаС (20 мл),нуклеазу с Зф-нуклеотидаэной активностьюэлюируют 20 мл 05 М раствора МаС. Скорость элюции 40 - 50 мл/ч.Этап 6. Концентрирование.Обьединение фракции с 3 -нуклеотидазной активностью диализуют против 50%-ного раствора глицерина. приготовленного на50 мМ Ма-ацетатном буфере рН 6 0 и хранятпри - 10 - 20 С,Определение активности ферментов/Определение 3 -нуклеотидазной активности нуклеазы.3 -Нуклеотидазную активность определяют по колориметрическому методу. Заединицу активности принимают количествоРн в микромолях, освобожденного за однуминуту гидролиза 3 АМФ при 37 С,Метод определения следующий: в пробирку для микропроб обьемом 1,5 см помещают 50 мкл исследуемого образцабелка, 100 мкл раствора 3 АМФ концентрации 7,5 мМ, 300 мкл буферного раствора -50 мМ ТЕА НС - ГаОН. рН 8,0: г робу,бируют 30 мин при 37"С. Реакцию с; а зг.ливают добавлением 50 мк, х;.ор сокислоты (9 н.), Иэ аналитически., гг оби рскотбирают по 100 мкл раствора0,4 мл 1 М ацетата натрия, ;татного буфера, рН 4, 0,4 мл:-,:., - ,1-ного раствора аскорбиновой кислоты,приготовленного на 1 мМ раствора сернокислой меди, Оставляют смесь на 10 минпосле чего добавляют 0,2 мл 1%-ного раствора молибдата аммония приготовленногона 0,05 н. Н 2504. Через 10 мин замеряютпоглощенные пробы на спектрофотсметрепри длине волны 660 нм. Расчет активнсстипроизводят по формулеЛ Евбо 14,6 100 т 31 где Л Е ббо - разность поглощения при /. = = 660 нм между опытным образцом и контролем (проба беэ белка);14,6 - коэффициент пересчета единиц поглощения, мкг Рн (определяемый по калибровке);с - время инкубации (30 мин);31 - атомная масса Р,Определение активностей примесны дефосфорилирующих ферментов.Определение активностей неспециф. чной фосфатазы, 5-нуклеотидазы и АТФ-аэы проводят аналогичным образом, используя в качестве субстратов соответственно /3-гл ицерофосфат, 5 АМ Ф, АТ Ф. П ри вы я влении фосфатазной активности с Р-глицерофосфатом применяют 50 мМ имидазольный буфер, рН 6,5.П р и м е р 2. Выбор условий тепловой обработки.Известно, что нуклеаза ячменя термостабильна при т = 60 С. Экспериментально показано (фиг.2), что при этой температуре происходит инактивация примесных дефосфорилирующих ферментов: 5-нуклеотидззы 60 . АТФ-азы 70. Поэтому целесооб)азно проведение при очистке целевого фермента тепловой обработки при 60.1 С (погрешность термометра), Длительность прогрева подбирают экспериментально. Наибольшее падение активности 5-нуклеотидазы и АТФ-аэы происходит за первые 15 мин нагрева при 60 С (фиг,2). При более длительном воздействии примесные активности остаются на прежнем уровн з, в то время как 3 -нуклеотидазная активнссть снижается, Исходя из полученных данных длительность прогрева выбрана 15 мин.40 45 50 55 П р и м е р 3, Подбор концентрации чаС для ступенчатой десорбции нуклеазы с ДЕАЕ-целлюлозы,Процедура выполнения до этапа 4 аналогична примеру 1, после чего осуществляют в аналитическом варианте десорбцию целевого фермента в градиенте йаС 0-0,2 М (150+ 150 мл) и определяют среднеарифметическое со среднеквадратичной ошибкой концентрации Ма С (фиг,б, срединная точка переднего фронта элюции),В табл, 2 показаны срединные точки переднего фронта элюции нуклеазы в М МаС при хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе в градиенте МаС (0-0,2) М,Как видно из табл, 2, концентрация МаС, необходимая для десорбции нуклеазы, 0,1 Т 0,01 М.П р и м е р 4. Подбор рН буферного раствора и концентрации ча С для проведения хроматографии на силохроме красно- коричневом,Процедура выполнения до этапа 5 аналогична примеру 1, после чего устанавливают интервал рН буфера для эффективной сорбции нуклеазы на силохроме при слабой сорбции дефосфорилирующих ферментов.В табл. 3 представлены данные сорбции нуклеазы с 3 -нуклеотидазной активностью и примесных ферментов на силохроме красно-коричневом при разных рН.Как видно из табл. 3, оптимальным значением рН является 8,0, так как несмотря на незначительную потерю активности при сорбции (порядка 10 ф) при этом рН резко ослаблено связывание примесных ферментов по сравнению с рН 6,0. При рН 9,0 рассматриваемые белки не адсорбируются.Выбор концентрации МаС для ступенчатой адсорбции примесного и целевого ферментов определяется эффективностью десорбции при рН 8,0.В табл. 4 показана десорбция нуклеазы и примесных ферментов с силохрома красно-коричневого при различных концентрациях ИаС (рН 8,0),Как видно из табл, 4, при концентрации 0,1 М чаС происходит десорбция оставшейся АТФ-азы и других белков, в то время как нуклеаза остается связанной с сорбентом, Десорбция целевого фермента начинается с концентрации 0,3 М йаС и достигает максимальной эффективности с 0,5 М МаС,Методика испытаний препарата, Нуклеазу из пзооростков ячменя применяют в синтезе (5- Р) ОАМФ и (5 ззР) АМФ на стадии перехода метки из (у- ЗЗР) АТФ в 5 10 15 20 25 30 35(и - Р) (О) АМФ. (у - Р) АТФ + 3 (О) АМФ полинуклеотид/киназа Зф - (5 - Р)(О)АДФ; З, 5 - Р)(О) АДФ нуклеаза/ячменя (5 Р)(О) АМФ+ Фн,Гидролиз З-фосфатной связи осуществляют как с очищенным после первой р,акции меченым продуктом (дифосфатом), так и в сквозном синтезе беэ предварительной очистки дифосфата, Существенно. что в обоих вариантах синтеза (а - Р)(О) АМФ рН реакционной среды 7,0-7,5.Реакцию проводят с 0,2 Е нуклеазы в течение 30 мин при 37 С; загрузка по радиоактивности составляет 45 мКи (у - Р) АТФ,33 Переход метки иэ (3,5 - Р)-дифосфата в (5- Р)-монофосфат составляет более 90, что рассчитывают по соотношению площадей пиков на хроматограмме НР С.Специфичность нуклеазы из ячменя к 3 -субстратам,Исследована субстратная специфич( ность нуклеаэы по отношению к 3 -нуклеозид-моно- и дифосфатам рибо- и дезоксириборяда,В табл, 5 приведены относительные активности (с 3 АМФ), проявляемые в области рН 7,0-8,5 (субстратная специфичность нуклеаэы из проростков ячменя),Из табл, 5 видно, что нуклеаза иэ ячменя проявляет 3 -нуклеотидаэную активность и по отношению к 3 -субстратам дезокси-ряда, в том числе к 3 ТМФ и 3, 5 ТДФ, однако скорость гидролиза приблизительно в 100 раэ меньше, чем с 3-рибонуклеотидами, Оптимум рН для рибонуклеотидов находится в области рН 8,0-8,5, для дезоксирибонуклеотидов - около 7,0. Формула изобретения 1, Способ очистки нуклеазы из проростков ячменя, включающий гомогенизацию сырья, экстракцию гомогената, фракционирование экстракта сульфатом аммония в интервале концентраций 40-80 насыщения, ионообменную хроматографию на носителе, содержащем диэтиламиноэтильные группы, и хроматографическую очистку, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, свободного от примесных АТ-фазной, 5-нуклеотидазной и неспецифической фосфатазной активностей, суспенэию белков после фракционирования сульфатом аммония подвергают термообработке при 60.1 С в течение 15 мин, ионообменную хроматографию проводят на ДЭАЭ-целлюлозе при рН 8,0 с элюцией фермента 0,1 М МаС, после чего проводят псевдоаффинную хроматографию на силохроме 50/80 красно-коричневом 2 К10 1703688 при рН 8,0 с предварительной элюцией примесных белков раствором 0,1 М МаС и элюцией целевого продукта 0,5 М ИаС 1. Таблица 1 3 -нуклеотидазная активность Примесные активности,0 лица аблиц ходный экстрактОсаждение сульфатом аммония (40- 80%) и и рогрев при 60 С Хроматография на ДЕАЕ- целлюлозе Хроматография на красно- коричневом силохроме Концентрирование диализом против 50%-ного глие ина 2, Способ по п,1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, в качестве источника фермента используют 4-6-суточные проростки ячменя.1703688 с 3 н": - ф,:е ая л"-а там2 О ЧЛ ЮЬНОСТЬ ПОГЮВй и 60 С, кн дг. 2240 зоо04 Ъеп элкатд,.ил1703688 5 Корректор Т, Мал еда ул каз 40 Тираж ВНИИПИ Государственного комитета 113035, Москва, Жи ГКНТ СССР оизв венно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 0522 СоставительТехред М.Мо меноал о изобрет35, Раушс 25150 ;7 съем элзитй 3 и Подписноеиям и открытия я наб., 4/5