Способ фракционирования нуклеиновых кислот

ГОСУДАРСТВЕННЫЙПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР МИТЕТОТКР ЫТИ 3 ИРЗЗР.", яц;р.1", рр, РЕ ЕНИЯ САНИЕ АВТОРСКОМУ С ТЕЛ ЬСТВ ение относится к биохимии и и, в частности к способам палратов нуклеиновых кислот, шияющихся в здравоохранении и зяйстве, Цель изобретения - бестоимости конечных продуко способа предусматривает поое осаждение уксуснокислым арных однонитчатых РНК 1,4 - пиральных РНК 2,5 - 3,0 М, а РНК и ДНК осуществляется иртом. Предложенный способ ижает себестоимость конечов 1. способствует улучшению й обстановки и условий труда, чает использование токсичных 43вательскиий инстиныхенного о и конструктут биологивеществ бъединения одгорный и А.В.Штан Яс, 19678, ч.8, М ч,5.5, М 6 р.1 -АНИЯ НУКнуклеотидны 15%-ным эта рибосомаль К; коланк ола, при это уются н омываю юируютс тные Р твие эта лом, при этом элюир е е примеси; колонку пр тналом, при этом эл яные и транспар Н У промывают в отсутс н м элюируются дсРНК,Недостатком известного способа является нетех.",алогичность; использование дефицитнога сорбента (целлюлоза ЦФ) и сложного оборудования (насос, проточный сектофотометр и т.д.), низкая производительность (нагрузка нуклеиновых кислот составляет 0,05 мг/г сорбента) и плохая эффективность разделения,Наиболее близким к предлагаемому является способ фракцианирования нуклеиновых кислот, заключающийся в том, что к раствору. нуклеиновых кислот добавляют хлористый литий до концентрации 2,0 Ч и выдерживают при 2-4 С; сформировавший(21) 4710241/13(54) СПОСОБ ФРАКЦИОНИРЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, в частности к способам получения препаратов нуклеиновых кислот, ширака применяющихся в здравоохранении и сельском хозяйстве.В настоящее время известен ряд методов фракционирования смРНК, дсРНК и ДНК. Однако большинство из них для применения в крупномасштабном производстве непригодны, так как обладают принципиальными недостатками; сложностью исполнения и использованием дорогостоящих (как правило импортных) реактивов.Известен способ фракционирования нуклеиновых кислот, включающий следующие последовательные стадии: препарат нуклеиновых кислот наносят на колонку с целлюлозой ЦФ(фирмы "Ватман", Англия), колонку промывают 35%-ным этано(57) Изабрет биотехнопоги учения препа рока примен сельском хо снижение се тов, Дпя этог следовательн калием сумм 2,2 М и двус осаждение Т этиловым сп на порядок сн ных продукт эколагическа так как исклю веществ,1692986 А 1ся осадск, содержащий смРНК 1",в основномоибосомальные и матричные), отделяютцетрифугированием в течение 15 - 20 минпри 10000 об/мин и температуре 2-4 С. Вдальнейшем центрифугирование проводятв этих же чсловиях, К надосадочной жидко, сти, соцержащей дсРНК, тРНК и ДН К, до оавляют хлористый литий до концентрации4,0 М и выдерживают при 2-4 С, Осадок,содержащий дсРНК, собирают центрифугированием, ДНК и тРНК, содержащиеся внадосадочной жидкости, осаждают, добавляя 1 - 2 объема этанола, Осадок собираютцентрифугированием.Б случае необходимости дополнительную очистку нуклеиновых кислот производят повторным фракционированиемхлористым литием или другими известнымиспособами,Недостатком известного способа является высокая стоимость хлористого лития,что увеличивает себестоимость препаратовнуклеиновых кислот, Кроме того, хлористыйлитий относится к токсичным соединениям.Исходя из этого использование хлористоголития для промышленного получения нуклеиновых кислот ухудшает условия труда иэкологически опасно,Целью изобретения является снижениесебестоимости препаратов,Способ заключается в следующем. Краствору нуклеиновых кислот добавляют уксуснокисл ый калий до концентрации 1,4 - 2,2Юи выдерживают при 2 - 4 С. Осадок, содержащий смРНК, собирают центрифугированием. К надосадочной жидкости.,содержащей дсРНК, ДНК и тРНК, добавляют уксуснокислый калий до полной конце"трацли 2,5 - 3,0 М и выдерживают при 2 - 4"С,Осадок, содержащий дсРНКсобирают ен.трифугированием, ДНК итРН К, содеркащлеся в надосадочнй жидкости, осаждают,добавляя 1- 2 объема этанола. Осадок соби.рают центрифугированием,По поедлагаемому способу используютдля фракционирования нуклеиновых кислотвместо хлористого лития уксуснокислый калий, что в 12 раз позволяет снизитьсебестоимость получаемых препаратов иотказаться от использования хлористого лития, при одновременном сохранении высокой эффективности фракционированиянуклеиновых кислот.П р и м е р 1, К препарату суммарныхкислот иэ килле рных дрожжейЗассйагогпусез сегеаз 1 ае, штамма ВКПМ У 448 киллерной системы К), растворенномув ЗО ил дистилированной воды, добавляют10 мл 8,0 М уксуснокислого калия (до конеч 10 15 20 25 ЗО 35 40 45 50 55 ной концентрации 2,0 М) и выдерживают 8 - 12 ч при 2 - 4 С.Осадок, содержащий смРНК, собирают центрифугированием и растворяют в 30 мл 0,05 М калий фосфатного буферного раствора рН 7,0), Из надосадочной жидкости отбирают аликвоту для электрофоретического анализа, К надосадочной жидкости добавляют 5,71 мл 8,0 М уксуснокислого калия (до конечной концентрации 2,7 5 М) и выдерживают 8 - 12 ч при 2-4 С, Осадок, содержащий дсРНК собирают центрифугированием и растворяют в 15 мл 0,05 М калий фосфатного буферного раствора рН 7,0), К надосадочной жидкости добавляют 90 мл этилового спирта и выдерживают в течение 8-12 ч при 2-4 С, Осадок, содержащий ДНК и тРНК, собирают центрифугированием и растворяют в 30 мл 0,05 М калий фосфатного буферного раствора (при 7,0). Из всех растворов нуклеиновых кислот отбирают аликвоты по 20 мкл и анализируют их состав электрофорезом в 10 -ном агарозном геле.Для сравнения эффективности фракционирования к 30 мл исходного раствора суммарных нуклеиновых кислот добавляют 10 мл 8,0 М хлористого лития (до концентрации 2 0 М) и выдерживают в 30 мл О 05 М калий фосфатного буферного раствора (рН 7,0), Из надосадочной жидкости отбирают аликвоту для электрофоретического анализа, К надосадочной жидкости добавляют 20 мл 8,0 М хлористого лития 1 до концентрации 4,0 М) и выдерживают в течение 8 - 12 ч при 2 - 4 С. Осадок, содержащий дсРНК, собирают центрифугированием и растворяют в 15 мл 0,05 М калий фосфатного буферного раствора 1,рН 7,0). К надосадочной жидкостл добавляют 120 мл этилового спиота и выдерживают в,течение 8-12 ч при 2-4" С,. Осадок, содержащий ДНК.и тРНК, собирают центрифугированием и растворяют в 30 мл 0,05 М калий фосфатного буферного раствора(рН 7,0). Из всех растворов нуклеиновых кислот отблрают аликвоты по 20 мл и анализируют их состав электрофорезом в 1;4-ном вгарозном геле.Из представленных оезультатов следует., что эффективность фракционирования смРНК, смРНК и ДНК с тРНК по предлагаемому и известному способам практически идентичны, При этом стоимость расходуемого на фракционировании реактива по предлагаемому способу в 12 ниже, чем по известному.Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить значительный экономический эффект, улучшить условия труда и экологическую обстановку на предприятиях, производящих препараты нуклеиновых1692906 Составитель Г. СтепановаТехред М,Моргентал Корректор М. Кучерявая Редактор Н. Рогулич Заказ 4048 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 кислот, а его применение способствует повышению эффективности производства, обеспечивающего здравоохранение и сельское хозяйство высокоэффективными средствами противо вирусной защиты и 5 стимулятора реэистентности организмов.формула изобретенияСпособ фракционирования нуклеиновых кислот, включающий последовательное осаждение смРНК и дсРНК возрастающими концентрациями соли щелочного металла, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью снижения себестоимости препаратов нуклеиновых кислот, в качестве соли щелочного металла используют уксуснокислый калий, причем смРНК осаждают при концентрации соли 1,4 - 2,2 М, а дсРНК - 2,5-3,0 М.