Способ определения содержания плазминогена в биологической жидкости

(19) (1) 51)5 6 01 й 33/5 Т лечении заболеваний, связанных с патологией системы гемостаза. Цель изобретения - ускорение способа. Для достижения цели биологическую жидкость разбавляют 0,05 М фосфатным буфером, затем на сорбенте лизин-агароза в соотношении сорбент - биологическая жидкость (1 - 2):1 проводят элюирование последовательно 0,1 М натрий-фосфатным буфером рН 7,4 и 0,01 - 0,1 М раствором е-аминокапроновой кислоты в указанном буфере, после чего спектрофотометрически определяют количество плэзминогена в злюате, Способ позволяет также устранить зависимость от видовой специ. фичности объекта исследования. 1 табл. 0,05 М натрий-Фосфатплазмы элюируют 0,1м буфером до нулевого Ос,нм. Биоспецифически Сооген элюируют 0,1 Мкапроновой кислоты втном буфере, рН 7,4, до уя раствора при 280 нм.я и элюции - 60 мл/ч,иногена в плазме расле ген, мг/ где ЬЕ = Е 28 о тинкции, изм читание эк представляет 17,0 - к- Ез 2 о - еренных стинкц собой и оэффиц см 28 йср плаэминогена в слабощелочдлине волны 280 нм пр ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБ ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(57) Способ относится к медицинской биохимии и может быть использован в клиниколабораторной практике при диагностике и Изобретение относится к медицинской биохимии и может быть использовано в клинико-лабораторной практике при диагностике и лечении заболеваний, связанных с патологией системы гемостаза.Цель изобретения - ускорение способа и устранение зависимости от видовой специфичности объекта исследования,Способ иллюстрируется следующими примерами,П р и м е р 1. Достоверность предложенного способа оценивают путем сравнительного определения количества плазминогена в модельной смеси.В свободную от плазминогена плазму объемом 2 мл вносят известное количество плазминогена (см. таблицу). На колонку, заполненную 2 мл лизин-агарозы (концентрация иммобилизованного лизина 1 - 3 мМ), наносят 2 мл цитратной плазмы крови, разбавленной в 2 разаным буфером БелкиМ натрий-фосфатныпоглощения при 280связанный плазминраствором я -амино0,05 М натрий-фосфанулевого поглощениСкорость нарастаниКонцентрацию плазмсчитывают по Форму ЛЕ Ч 2мл,17 0разница величин экспри 280 и 320 нм (выии при 320 нм оправку нэ мутность); иент экстинкции10 15 25 мл,Ч 1 - объем взятой для анализа плазмы, Ч 2 - объем спектрофотометрируемого раствора.В нашем случае: ЬЕ = 0,114; Ч 1 = 2 мл; Ч 2=4 мл,Концентрация плазминогена0,114 410 = 0,135 мг/мл плазмы. Как видно из таблицы, весь внесенный в плазму плазминоген биоспецифически связывается с аффинным сорбентом и затем полностью элюируется я-аминокапро,новой кислотой при соблюдении предложенных условий.П р и м е р 2. Определение и расчет проводят так же, как. в примере 1, но для определения берут 1 мл плазмы, а для элюирования плазминогена 0,01 М раствор яаминокапроновой кислоты в 0,05 М йа-фосфатном буфере.Ч 1 = 1 мл; Чг =.3 мл; ЬЕ = 0,076,Концентрация плазминогена 0,076 310 = 0,135 мг/мл плазмы. Кроме того, содержание плазминогена определяют и в других биологических жидкостях.П р и м е р 3. 2 мл синовиальной жидкости больного ревматоидным артритом разводят в 2 раза 0,05 М натрий-фосфатным буфером, наносят на колонку, заполненную 2 мл лизин-агарозы, промывают 0,1 М натрий-фосфатным буфером, рН 7,4. Элюирование плаэминогена проводят 0,1 М раствором я-аминокапроновой кислоты в 0,05 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,1, затем спектрофотометрируют, как в примерах 1 и 2.При этом ЬЕ = 0,062; Ч 1 = 2 мл; Ч 2 = 4 мл.Концентрация плазминогена 0062 410 = 0,073 мг/мл.Концентрация плазминогена в синовиальной жидкости 16 больных ревматоидным артритом (в период обострения) составила 0,0668 .ф. 0,0079 мг/мл,П р и м е р 4, 1 мл цитратной плазмы крови мыши (пул 5 особей) разбавляют в 2 раза 0,05 М натрий-фосфатным буфером, рН 7,4, и наносят на колонку, заполненную 2 мл лизин-агарозы. Элюирование проводят в два этапа: сначала промывка, а затем связанный плаэминоген элюируют 0,01 М раствором я-аминокапроновой кислоты (пример 1).При этом ЬЕ = 0,055; Ч 1 = 1 мл; Ч 2 = 2 20 30 35 40 45 50 Концентрация плазминогена0 055. 2 7 1 1 0 = 0,065 мг/мл. П р и м е р 5. 2 мл цитратной плазмы крови свиньи разбавляют в 2 раза 0,05 М натрий-фосфатным буфером рН 7,4, и наносят на колонку., заполненную 2 мл лизин-агароэы. Последующие операции элюирования осуществляют, как описано в примере 1.При этом ЬЕ = 0,102; Ч 1 = 2 мл; Ч 2 = 4 мл.Концентрация плазминогена - 10 = 0,120 мг/мл.0,1 О 2 4 П р и м е р 6. 2 мл цитратной плазмы крови собаки разводят в 2 раза 0,05 М натрий-фосфатным буфером, рН 7,4, Последующие операции элюирования осуществляют, как описано в примере 1.При этом ЬЕ = 0,063; Ч 1 = 2 мл; Ч 2 = 3 мл,Концентрация плаэминогена0,063 3х 10 = 0,056 мг/мл,Для доказательства достоверности и точности нового метода полученные результаты сравнивают с известными из литературных источников данными: количество плазминогена в плазме крови в норме составляет в соответствии с литературными данными 1,5 - 2 ММ или в среднем 0,158 мг/мл; 0,120 мг/мл, а у 12 больных ревматоидным артритом в плазме 0,172 и синовиальной жидкости 0,065 мг/мл при определении иммунохимическим способом. Результаты, получаемые согласно предлагаемому способу, составляют в плазме крови для здорового человека 0,135 +0,0037 мг/мл, у больных ревматоидным артритом - 0,171 + 0,115, у пациентов болезнью Крона она колеблется от 0,080 - 0,120 мг/мл; в синовиальной жидкости количество плаэминогена у 16 больных ревматоидным артритом в период обострения составляет 0.0668 + 0,0079 мг/мл,Использование нового метода определения плазминогена позволяет значительно сократить время анализа 1 ч по сравнению с 24 ч по способу-прототипу), При этом точность метода сохраняется достаточно высокой, что соответствует литературным данным и результатам экспериментального анализа и клинических исследований.Использование способа позволяет также проводить определение плазминогена у различных животных не зависимо от видовой специфичности,1681255 Формула изобретения Составитель В. МитюшинРедактор Л. Веселовская Техред М.Моргентал Корректор С. Шевкун Заказ 3310 Тираж 389 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Способ определения содержания плазминогена в биологической жидкости путем разделения и детектирования продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения способа и устранения зависимости от видовой специфичности объекта исследования, биологическую жидкость разбавляют в два раза 0,05 М фосфатным буфером, проводят злюирование на сорбенте лизин-агароза в соотношении сорбент; биологическая жидкость 1 - 2):1. 0,1 М натрий-фосфатным буфером рН 7,4 и 0,01 - 0,1 М раствором я-аминокапроновой кислоты в 0,05 М натрий-фосфатном буфере и в элюате определяют плазминоген спектрофотометрически,