Реагент для определения концентрации глюкозы в сыворотке крови

союз соВетскихСОЦИАЛ ИСТИЧ Е СКИХРЕСПУБЛИК я)5 С 1 ВИДЕТЕЛ ЬСТВУ К АВТОРСКО титут биоорганиче- Р, Межотраслевое ное ооьединение научно-исследован и сывороток Научго объединения булдаева, С.Н.ЗаМ.В.Колмакова, а, В.К,Старостина, атова, И.Д.СтальЯцентюкЯЛ., ГЫегэ В,Е,/ 315 - 320. кие лабораторные о 0,22 г- 4 ед.акт./л 1 л - 1 ед.акт./мп 0,34 ммоль,л до 022 г ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР(71) Новосибирский инсской химии СО АН СССнаучно-производствен(56) Яц О.Т., ТаовеуС п.СЬев., 1975, ч,21, р.биометрия, М., 1973Тодоров И, Клиниче исследования в педиатрии, София,физкультура, 1968, с.582,Изобретение относится к медицинской биохимии, аналитической химии, а именно к созданию наборов реактивов, позволяющих определять глюкозу в сыворотках крови ферментативным методом.В основу наборов положен ферментативный метод. заключающийся в том, что глюкоза окисляется кислородом воздуха при каталитическом действии глюкозооксидазы (ГОД), с образованием перекиси водорода и Р -глюконолактона, Образовавшуюся перекись водорода определяют по индофеноловой реакции 4-аминоантипирина (4-ААП) с хромогеном, катализируемой пероксидазой. Количество образовавшегося красителя при 77 бб 92 А 1 28,6 01 И 33/48,33/573(54) РЕАГЕНТ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ(57) Использование: в медицинской биохимии и аналитической химии для определения глюкозы в сыворотках крови. Цель; повышение точности определения, удешевление стоимости реагента и увеличение его стабильности, Сущность изобретения: реагент для определения глюкозы представляет собой смесь следующих ингредиентов: глюкозооксидаза 4,5 - 9,0 ЕД, пероксидаза 0,25 - 2,0 ЕД, 4-аминоантипирин 0,019-0,056 мг, фенол 0,27-1,29 мг, лошадиный сывороточный альбумин 5 - 10 мг, фосфатный буферный раствор рН 6,2-7,2 - 1 мл, Положительный эффект: сокращается расход реактивов, повышается воспроизводимость анализа, увеличивается срок хранения реактива до 7 недель,блюдении рабочих условии ильно содержанию глюкозы,Известны наборы реактивов для определения глюкозы в сыворотках крови ферментативным методом.Известен набор реактивов для определения глюкозы ферментативным методомвключающий следующие компоненты в указанных концентрациях:1. Смесь ферментовГлюкозооксидазаПероксидаза4-аминоантипНатрий серно й2. Хромоген (1,0 г) - 4-хлор-метилфенол 0,3 ммоль/л со Словасолом 0 и натрием сернокислым.3. Буферный раствор - трис 0,91 моль/л рН 8,3. 54; Эталон глюкозы - 25 ммоль/л.Недостатками данного набора являются1. Малый срок хранения набора реактивов в растворе, который составляет 1-2 недели.2. Применение в качестве хромогена малодоступных реактивов -4-хлор-метилфенола и Словасола О,3, В практической лаборатории воспроизводимость метода с использованием данного набора невелика и составляет 8,80 .Наиболее близким к заявленному является набор реактивов для определения глю.козы ферментативнцм методом, который 20состоит из следующих компонентов в указанных концентрациях:1, Буфер, ферменты;, 4-ААП - фосфатный буфер 100 ммоль/л рН 7,0; ГОД 18ед.акт./мл; пероксидаза 1,1 ед,акт./мл; 4- 25ААП - 0,77 ммоль/л2, Фенол - 11 ммоль/л3. Этанол глюкозы - 0,505; 5,55ммольл,Недостатками прототипа являются: 301, Большой расход реактивов: ГОД - 18ед.акт./мл; фенола - 11 ммоль/л; 4-ААП 0,77 ммоль/л.2, Малый срок хранения набора в растворе: 4 недели при температуре (2-8)С. 353, Сложность приготовления набора изза фиксированных значений концентрациикомпонентов набора.Целью изобретения является улучшение воспроизводимости анализа, удешевление стоимости реагента и увеличение егостабильности при сохранении правильности определения глюкозы.Поставленная цель достигается созданием набора, содержащего следующие компоненты в указанных концентрациях:Ферментная смесь: при отношении активностей ГОД/пероксидаза от 18 до 4,51, ГОД - 4,5-9,0 ед,акт./мл2. Пероксидаза - 0,25-2,0 ед.акт./мл 503. 4-ААП - 0,19-0,056 мгмл4, Фенол - 0,27-1,29 мг/мл5. Лошадиный сывороточнцй альбумин(ЛСА)" 0,1-10,0 мг/мл6. Буферный раствор,1 моль/л, калий 55фосфат (рН 7,0 + 0,5) - остальное,Определяющими отличительными признаками набора реактивов являются:- подобранное соотношение концентраций компонентов набора;- введение в ферментную смесь стабилизатора ЛСА, что позволило:1. Сократить расход реактивов, за счет чего значительно удешевить стоимость набора,2. Повысить воспроиэводимость анализа (с ЛСА - 3,9, без ЛСА - 5,70 ),3. Увеличить длительность хранения раствора набора до 7 недель.Предлагаемое изобретение иллюстрируется примерами.Активность ферментов определяли по известным методикам.П р и м е р 1. К 1 мл раствора набора реактивов(концентрация которых указана в таблице) добавили 10 мкл сыворотки "Ргес 111 р" (содержание глюкозы в ней 5,67- 6,53 ммоль/л). Раствор перемешивали, выдерживали 40 мин при комнатной температуре и измерили оптическую плотность исследуемого раствора и эталона глюкозы с концентрацией 10 ммоль/л на спектрофотометре при длине волны 510 нм в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 1 см. Результаты анализа приведены в табл, 1.Как видно иэ табл. 1, при соотношении активностей ГОД/пероксидаза от 4,5 до 18 данным набором глюкоза определяется .правильно(М 1 - 3,6), При большем - 22,5 и меньшем - 3,0 отношении активностей ГОД/пероксидаза результаты анализа неправильным (М 4 - 5).П р и м е р 2. Проведение анализа аналогично примеру 1. Концентрации компонентов и результаты анализа представлены в табл. 2,Как видно из табл. 2, наборы правильно определяют глюкозу при концентрации ГОД от 4,5 до 9 и более ед.акт./мл(%1 - 3,5); при меньшей концентрации ГОД глюкоза определяется неправильно (М 4).При фиксированном значении ГОД и пероксидаэы наборы правильно определяют глюкозу при концентрации 4-ААП от 0,019 до 0,056 мг/мл (ЬЬ 3, 6, 7), при концентрации 4-ААП меньше 0,019 мг/мл и больше 0,056 мг/мл глюкоза определяется неправильно (Ь 8, 9).П р и м е р 3. Проведение анализа аналогично примеру 1, концентрации компонентов и результаты анализа представлены в табл, 3.Как видно из табл. 3, наборы правильно определяют глюкозу при концентрации фенола от 0,27 до 1,29 мг/мл (М 1 - 3), и при концентрациях ЛСА от 0,1 до 10 мг/мл (В 6 - 12). При меньшем содержании фенола - 0,20 мг/мл (В 4) и большем содержании фенола - 1,42 мг/мл (М 5) и ЛСА - 111776692 0,25 - 2,0 Ед Таблица 1еюа вееватевеюи июи втвеютвиаиивиттиНаименование и концентрация компонентов Определеноглюкозы,ммоль/л Отношение ГОД к пероксидазее 1 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0+0,5; ГОД 4,5 ед.акт./мл; пероксидазы 0,25 ед.акт./мл; 4-ААП 0,019 мг/мл; фенол 0,27 мг/мл; ЛСА 0,1 мг/мл. 18,0 2 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферногораствора рН 7,0+0,5:ГОД 9 ед.акт,/мл;пероксидазы 1 ед.акт,/мл;4-ААП 0,056 мг/мл; фенол 1,29 мг/Мл;ЛСА 0,1 мг/мл. 9,0 6,03 4 5 3 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферногораствора рН 7,0+0,5:ГОД 8 ед.акт./мл;пероксидазы 1,8 ед.акт,/мл;4 ААП 0,056 мг/мл; фенол 0,27 мг/мл;ЛСА 0,1 мг/мл. 5,54 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферногораствора рН 7,0+0,5:ГОД 9 ед.акт./мл;пероксидазы 3 ед.акт./мл;4 ААП 0,056 мг/мл; фенол 0,27 мг/мл;ЛСА 0,1 мг/мл. 5,62 гг,5 5 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0+0,5:ГОД 4,5 ед.акт/мл; пероксидазы 0,2 ед.акт ./мл; 4-ААП 0,056 мг/мл; фенол 0,27 мг/мл; ЛСА 0,1 мг/мл. 6,25 4,5 6 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферногораствора рН 7,0 ф 0,5:ГОД 9 ед.акт,/мл;пероксидазы 2 ед,акт./мл;4-ААП 0,056 мг/мл; фенол 0;27 мг/мл;ЛСА 0,1 мг/мл. мг/мл (ЬЬ 13) глюкоза определяется неправильно.ЛСА в концентрации 11 мг/мл образует в растворе набора опалесценцию и тем самым искажает результаты определения глю козы. Хотя концентрация ЛСА 0,08 мг/мл позволяет правильно определять содержание глюкозы, она не обеспечивает хорошей воспроизводимости результатов и существенно не увеличивает срок хранения раство ра набора. Формула изобретения Реагентдля определения концентрации 15 глюкозы в сыворотке крови, содержащий глюкозооксидазу, пероксидазу, 4-аминоана типирин, фенол и фосфатный буферный раствор рН 6,8-7,2, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения точности определения, удешевления стоимости реагента и увеличения его стабильности, он дополнительно содержит лошадиный сывороточный альбумин при следующем соотношении компонентов:Глюкозооксидаза 4,5 - 9,0 ЕД Пероксидаза4 Аминоантипирин 0,019-0,056 мг Фенол 0,27-1,29 мг Лошадиный сывороточный альбумин 5-10 мг Фосфатный буферный раствор рН 6,8-7,2 1 мл1776692 Табли ца 2 Наименование и концентрация компонентов Определеноглюкозы,ммоль/л 6,20 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферногораствора рН 7,0+0,5;ГОЛ 9 ед.акт./мл;пероксидазы 1,0 ед.акт./мл;4-ААП 0,056 мг/мл; фенол 0,27 мг/мл;ЛСА 0,2 мг/мл. В 1 мл 0,1 моль/л Фосфатного буферногораствора рН 7,0+0,5: ГОД 7 ед.акт./йл;пероксидазы 1 ед.акт,/мл;4-АПП 0,056 мг/мл; Фенол 0,27 мгlмл;ЛСА 0,2 мг/мл.В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферногораствора рН 7,0+0,5:ГОД 3 ед.акт,/мл;пероксидазы 1 ед.акт,/мл;4-ААП 0,056 мг/мл; Фенол 0,27 мг/мл;ЛСА 0,2 мг/мл. В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферногораствора рН 7,0+0,5;ГОД 18 ед.акт./мл;пероксидазы 1 ед,акт,/мл;4-ААП 0,056 мг/мл; Фенол 0,27 мг/ил;ЛСА 0,2 мг/мл,В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферногораствора рН 7,0+0,5:ГОД 9 ед.акт./мл;пероксидазы 1 ед,акт./млф4-АПП 0,019 мг/мл; Фенол 0,27 мг/мл;ЛСА 0,2 мг/мл. В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферногораствора рН 7,00,5: ГОД 9 ед.акт./Мл;пероксидаэь 1 1 ед.акт.lмл;4"ААП 0,056 мг/мл; фенол 0,27 мг/мл; .ЛСА 0,2 мг/мл. 6,41 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферногораствора рН 7,0+0,5:ГОД 9 ед.акт./мл;пероксидаэы 1 ед.акт./мл;4"АПП 0,016 мг/мл; фенол ,27 мг/мл;ЛСА 0,2 мг/мл,В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферногораствора рН 7,0+0,5; ГОД 9 ед.акт./мл;пероксидазы 1 ед.акт./мл;4-РАП 0,062 мг/мл; фенол 0,27 мг/мл;ЛСД 0,2 мг/мл,5,60 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферногораствора рН 7,0-0,5:ГОД 4,5 ед.акт,/мл;пероксидазы 1 ед.акт./мл; 4-АПП 0,056 мг/мл;фенол 0,27 мг/мл; ЛСА 0,2 мг/мл.10 1776692 Таблица 3 Наименование и концентрации компонентов Определеноглюкозы,ммоль/л аааааееееее еее ае 5,71 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферногораствора рН 7,0 ф 0,5: ГОД 9 ед.акт./мл;пероксидазы 1 ед.акт./мл;4-РАП 0,050 мг/мл; фенол 0,27 мг/мл;ЛСР О, 1 мг/мл,В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферногораствора рН 7,0-0,5:ГОД 9 ед.акт./мл;пероксидазы 1 ед.акт,/мл;4-ААП 0,050 мг/мл; фенол 1,29 мг/мл 1ЛСА 0,1 мг/мл. 5,82 5 е 4 6,69 6,20 6,18 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферногораствора рН 7,0 ф 0,5;ГОД 9 ед.акт./мл;пероксидазы 1 ед,акт./мл;4-ААП 0,050 мг/мл; фенол 0,65 мг/мл;ЛСА 0,1 мг/мл.В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферногораствора рН 7,0-0,5:ГОД 9 ед.акт./мл;пероксидазы 1 ед.акт,/мл;4-ААП 0,050 мг/мл; фенол 0,20 мг/мл;ЛСА О, юг/мл.В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферногораствора рН 7,0+0,5:ГОД 9 ед.акт./мл;пероксидазы 1 ед.акт./мл;4-ААП 0,050 мг/мл; фенол 1,42 мг/мл;ЛСА 0,1 мг/мл.В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферноюраствора рН 7,0+0,5:ГОД 9. ед.акт./мл;пероксидазы 1 ед.акт./мл;4-АПП 0,050 мг/мл; фенол 0,65 мг/мл;ЛСА 0,2 мг/мл.7 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферногораствора рН 7,0-0;5:ГОД 9 ед,акт./мл;пероксидазы 1 ед.акт.мл;4-ААП 0,050 мг/мл; фенол 0,65 мгмл;ЛСА 0,1 мг/мл.8 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферногораствора рН 7,0+0,5:ГОД 9 ед.акт./мл;пероксидазы 1 ед.акт./мл;4-ААП 0,050 мг/мл; Фенол 0,65 мг/мл;ЛСА 0,15 мгlмл.9 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферногораствора рН 7,0+0,5:ГОД 9 ед,акт./мл;пероксидаза 1 ед.акт./мл;4-ААП 0,050 мг/мл; фенол 0,65 мг/мл;ЛСА 0,08 мг/мл.1776692 Продолжение табл,10В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферногораствора рН 7,00,5:ГОД 9 ед.акт./мл;пероксидазы 1 ед.акт./мл;4-ААП 0,050 мг/мл; фенол 0,65 мг/мл;ЛСА мг/мл. 5,90 11 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферногораствора рН 7,0+0,5: ГОД 9 ед.акт./мл;пероксидазы 1 ед.акт,/Мл;4-ААП 0,050 мг/мл; фенол 0,65 мг/мл;ЛСР 2 мг/мл. 5,75 12 В 1 мл О, моль/л фосфатного буферногораствора рН 7,0"0,5;ГОД 9 ед,акт./мл;пероксидазы 1 ед.акт./мл;4-ААП 0,050 мг/мл; фенол 0,65 мг/мл;ЛСА 1 О мг/мл. 5,70 13 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферногораствора рН 7,0+0,5;ГОД 9 ед.акт./мл;пероксидазы 1 ед.акт./мл;4-ААП 0,050 мг/мл; фенол 0,65 мг/мл;ЛСА 11 мг/мл. б,60 Составитель В,ПупковаТехред М,Моргентал Корректор О,Густи Редактор Т,Иванова Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 Заказ 4101 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5