Способ получения коньюгата

СОЮЗ СОЦИА РЕСПУБ СОВЕТСКИХ ИСТИЧЕСНИХ ИНКОНЬЮГАТАили егоанного с ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССС О ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬ 21) 3378149/2(72) Джордж фердинанди Робин Джордж Симмонтания)(56) 1. Гринш мия аминокисл "Мир", 1965, (54)(57) СПО на основе ию фрагмента, к 1-5 группами тейн Дж., В от и пептид с. 446.СОБ ПОЛУЧЕНИ 1 уноглобулин овалентно св формулы отличающий муноглобулин дС или подвергают взаимодей ствующим молярным ко дезацетилвинбластино рН 8,5-9,5 и темпера его фрагмент твию с соответичеством азидаой кислоты приуре 5-25 ф С.Изобретение относится к способам получения нового коньюгата на основе иммуноглобулина, обладающего противо- раковой активностью.Известна реакция ацилирования пеп тидов азидамикислот С 11, 5Цель изобретения - получение нового иммуноглобулинового коньюгата, обладакиаего ценНыми,противораковыми сврйствами.Поставленная цель достигается 10 тем, что согласно способу основанному на реакции получения коньюгата на основе иммуноглобулина 1 дС или его фрагмента, ковалентно связанного с 1-5 группами формулы 15ОН 20 о-сн,К 21 дС коэ и овец, иммунизированныхкарционозмбрионным .антигеном,1 дС острой лимфобластической лейкемической антисыворотки кроликов,1 дС из антисыворотки различныхприматов, предназначенной против острой лимфобластической лейкемии, острой миелобластической лейкемии, хронической лимфобластической лейкемииихронической гранулоцитоксической5 лейкемии,:1 яС коз и овец, иммунизированныхвеществом, вызывающим рак легких;моноклональный 1 дС из гибридомас 1 Ж фрагментс соответ-.вом азида слоты при антитела,1 дС иэ гибридомасующей античеловеантитела; ,1 дС,гибридомассыниаий антитела,ами человеческо 5 0 реай ле лизиненныхреакяет С гибридомассыантитела, реаыми раковыми6 г домассыан а, реаомн раковыми быть легко ульфататилвинбласого гидрази ющим диаэо- винбластина ибрититеыми аг п%иммуноглобулин 1 дС или егоподвергают взаимодействиюствующим молярным количестдеэацетилвинбластиновой кирН 8,5-9,5 и 5-25 фС.При проведении реакции раствор азида в подходящем растворителе, таком как диоксан, медленно по каплям добавляют к буферному раствору иммуноглобулина, например в 0,35 Мборатном буфере при рН 9. Коньюгат выделяют методом гелевой фильтрации и хранят в насыщенном растворе сульФата аммония, который можно легко вернуть в исходное состояние путем диализа с помощью боратного буфера, или его можно сохранить в холодильнике при 44 С или в,замороженном состоянии, например при - 20 С. В результате происходит образование ковалентной связи между одной или более винса-фрагментами и свободным аминогруппами иммуноглобулиновой молекулы, например аминогруппами новых остатков. Число присоеди фрагментов зависит от концентр реагентов и продолжительности ции, однако обычно оно составл величину порядка 1,2-5. Азидный реагент можетполучен иэ винбластина,винбластина или иэ деэацтина путем предпочтительнолиэа С -эфира с последэтирован нем. Гидраэинолиэ при умеренных температурах в растворе метанола протекает с образованиемпреимущественно моногидразида, и реакция такого продукта при 0-10 С ссоляной кислотой и нитритом натрия вподходящем водном растворителе даетжелаемый азид деэацетилвинбластиновойкислоты,Указанный азид может быть полученпри температурах ниже 5 С согласноуказанному и без выделения азида,рНустанавливают равным 9 и добавляютсмешивающийся с водой растворитель,например такой как диоксан. Затемдобавляют иммуноглобулин в боратномбуфере, имеющем рН 9, и температуререакционной смеси дают повышаться докомнатной. Избыток азида разрушаютразбавленным аммиаком, и коньюгаточищают гель-фильтрацией, они могутнаходит применение в лечении животных, а также в контрольных и аналитических экспериментах,В качестве исходных иммуноглобулинов могут служить следующие вещества: сы мышей, секретирующей античелове ческие карциномные.моноклональнысы мышей, секретирческие меланомныемоноклональныймышей, секретиругирующие с клетккемии;моноклональный 1 дС гибридомассы мышей, секретирующий антитела, реагирующие с человеческими нейробластомными клетками;моноклональный.1 аСгибридомассы мышей, секретируниаий антитела, реагируниаие с человеческими грудными раковыми антителами: моноклональный 1 амышей, секретируниаийгирующие с яичниковклетками человека;моноклональный 1 дьыаей, секретирующийгирующие с остеосаркпомощью иммуноглобулиновых фрагментов, таких как аВ, РаВ или Г(аВ) или 1 дМ мономер, полученный из анти. тела, например путем протеолитического энзимного расщепления, Такие вещества и методы их и ,учения хоро. 5 шо известны.Коньюгаты, получаемые по предлагаемому способу, могут найти применение в лечениираковых опухолей,Коньюгаты эффективны в широком 0 диапазоне доз и могут применяться для лечения взрослых пациентов в дозе 1-10 мг/кг (виденсиновый фрагмент), обычно в интервале 3-9 мг/кг,П р и м е р 1. Получение овечье го виндесин-антикарциноэмбрионного антигенного коньюгата.Гидразид дезацетилвинбластиновой кислоты (б мг) растворяют в 1 И растворе НС 1 (340 мл) и полученный раствор охлаждают до 4 С. 60 мкл водного раствора нитрита натрия, имеющего концентрацию 10 мг/мл добавляют к получениой смеси и ее перемешивают при 4 С. Через 5 мин при интенсивном перемешивании добавляют 1 И раствор .МаОН (300 мл) и диоксан (120 мл), после чего вносят 280 мл раствора овечьего антикарциноэмбригенного анткгена, имеющего концентрацию 21,3 мг/мл,в среде боратного буфера с концентрацией 0,34 М-при рН 8,6. Псщученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч,. поддерживая рН 9 с использованием 0,1 И раствора МаОН, Избыток азида разрушают путем добавления 1 И раствора аммиака (60 мл) при перемешивании в течение часа. Полученный продукт выделяют методом гель-фильтрации на колонке размерами 1 к 25,5 см (20 мл) 40 с био-гелем Р-б, уравновешенным фосфатным буферным физиологическим раствором. Исключенный пйк собирают (2,66 мл) и определяют в нем содержание протеина по методу Лоури и со держание виндесина методом разностной спектроскопии. Полученный таким образом коньюгат содержит 4,6 моль винденсина на моль 1 дС.50П р и м е р 2, Получение мышиного винденсин-моноклонального антикарционоэмбрионного антигенного коньюгата.Гидраэид дезацетилвинбластиновой 55 кислоты (10 мв) растворяют в Щ соляной кислоте (0,56 мл) и полученный раствор охлаждают до 4 С, 100 мкл раствора нитрита натрия с концентрацией 10 мг/мл добавляют к реакцион ной смеси и последнюю, перемешивают при 4 фС. Через 5 мин при интенсивном перемешивании добавляют 1 Х раствор едкого натра (0,5 мл) и диоксан (0,2 мл), после чего добавляют 0,5 мл 65 раствора мышиного моноклональногоантикарционо-эмбрионного антигена,имеющего концентрацию 15,6 мг/мл врастворе 0,34 боратного буфера прирН 8,6. Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч, поддерживая при этом рН9 путем добавления 0,1 И раствора едкого натра. Избыток азида разрушаютдобавлением 1 М раствора гидроокисиаммония (0,1 мл) и перемешиваниемеще в течение часа. Продукт реакциивыделяют методом гель-фильтрации наколонне размерами 1 х 27 см (21 мл) сбио-гелем Р-б, уравновешенным фосфатным буферным физиологическим раствором. Исключенный пик собирают(4,07 мл) и определяют содержание внем протеина и виндесина методомспектроскопии при 270 н 280 нм., Полученный таким образом коньюгат содержит 2,1 моль виндесина на моль1 дС.П р и м е р 3. Получение кроличьего виндесин-противомышиного 1 дСконьюгата,Гидразид деэацетилвинбластиновойкислоты (12 мг) растворяют в 1 И соляной кислоте (0,67 мл) и полученныйраствор охлаждают до 4 С. Добавляют120 мкм раствора нитрита натрия сконцентрацией 10 мг/мл и реакционнуюсмесь перемешивают при 4 фС. Через5 мин при интенсивном перемешиваниидобавляют 1 Ы раствор едкого натра(0,6) и диоксан (0,24 мл), после чего добавляют 1,0 мл раствора кроличьего антимышиного 1 дС с концентрацией 11,7 мг/мл в 0,34 М растворе боратного буфера при рН 8.6. Полученнуюсмесь перемешивают при комнатнойтемпературе в течение 2 ч, поддерживая при этом рН 9 с использованием0,1 М раствора едкого натра. Избытоказида разрушают добавлением 1 И раствора гидроокиси аммония (0,12 мл)и перемешиванием в течение часа. Продукт реакции выделяют методом гельфильтрации на колонке размерами1,5-26 см (46 мл) с био-гелем Р-б,уравновешенныМ,.фоофатным буфернымфизиологическим раствором. Исключенный пик собирают (6,22 мл) и определяют в нем содержание протеина и виндесина методом спектроскопии при270 и 280 нм. Полученный таким образом коньюгат содержит 3,2 моль виндесина на моль 1 дС.П р и м е р 4. Препарат клеток,выращенных в культуральной среде,переливают в тарелки с микротитрованной культурой, содержащей 10" клетокна стенкуПосле укоренения клеток втечение 24 ч отогнутые стенки обрабатывают различными концентрациямиконьюгата или контрольным ооединением. Через б дн. культивирования чис1069628 в молярном соотношении, равном 2,1 моль виндееина. на моль 1 р( (коньюгат примера 2), и цитостатический эффект измеряют путем подсчета клеток.5 Число клеток в расчетена стеку через 6 дн,(среднее значение +стандартное отклонение)4 повторения Концентрацияконьюгированного веществаЗаказ 11509/60 Тираж 414 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035 у Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5Филиал ППП "Патентф, г.умгород, ул.Проектная, 4 ло клеток, находящихся на стенках, оценивают непосредственным подсчетом с использованием видового анализатора, присоединенного к микроскопу.Семейство аденокарционных клеток толстой кишки человека обрабатывают виндесином, связанным с моноклональным антикарциноэмбрионным антигеном Результаты опытов приведены втаблице.