Способ селекции слабовирулентных клонов листерий

СОЮЗ СОВЕТСНИХС 1 МИИДЮЕСИИРЕСПУБЛИН г; - .ЕТЕН СКОМУ Сви ЕТ К дит к 1000-кра 1 ю вирулентностиания антибиотиоло гнисв янтных штаммо т избежать испыулентных свойствио тикоустойчиащает время и а их получени м стрепт (фосфат рН 7,2- 3,0 мл Раство рь Филь тро пор 0,2 омицинано солев7,4) гокаждый в антиамицинатбо ромо рфоло.г л,анти ванием2 мкм и омв ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОЧНРЫТПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии(56) ГепзгегЬап 1. К. Яе 1 есс 1 оп ег сагасгегзаг 1 оп Й ипе зоцсЬе часспа 1 е йе 1.1 зег 1 а шопосусояепез пурочдгц 1 епге розг 1 а зог 1 з. - В кн, 1,з :.гег 1 зе, 1.1 згег 1 а, 1.згег 1 озз./Под ред. А,1,. Соцгг 1 еи, Е.Р. Езрахе. А.Е. Кеупапй, 1985, р. 209-217. Изобретение относится к ветеринарной и медицинской микробизано с получением авирулелистерий для создания средств специфической профилактики листериоза и может быть использовано в научноисследовательских и производственныхх лабораториях, занимающихся проблемой листериоза.Целью изобретения является снижение вирулентности клонов за более короткий срок.Способ заключается в применении в качестве селективных факторобиотиков стрептомицина и канс последующим направленным ослабовирулентных клонов по м и ческим признакам клеток при микроско,.80164 О 162 А 1(54) СПОСОБ СЕЛЕКЦИИ СЛАБОВИРУЛЕНТНЫХ КЛОНОВ ЛИСТЕРШ(57) Изобретение относится к ветеринарной и медицинской микробиологии, связано с получением авирулентных штаммов листерий. Целью изобретения является снижение вирулентных клонов эа более короткий срок, Способ заключается в том, что методом селекции на средах с антибиотиками получают клоны, устойчивые одновременно к стрептомицину (100 мкг/мл) и канамицину (50 мкг/мл), отбирают клоны, клетки которых превышают длину клеток исходного штамма в 2-3 раза, и определяют их вирулентные свойства.2 табл.% пировании, что прив ному и более снижен за счет нового соче ков, а также позволя тания на животных в всех полученных ант вых мутантов, что с материальные затрать и выявление.Рабочие растворыи канамицина в ФСБм буферном раствореовят в количествеконцентрацией 5 мг/иотиков стерилизуютереэ фильтры с раэмехранят до применениязамороженном состоянии при (-20)(+1)9 С.Бульон и.-агар ВН 1 готовят по имею.щимся прописям к соответствующим сре 5дам. Агар ВН 1 разливают в чашки Петридиаметром 100 мм по 20 + 2 мл.Приготовление антибиотикосодержащего бульона ВН 1 проводят добавлениемнеобходимого объема рабочего раствора 10антибиотика к стандартному бульонунепосредственно перед посевом листеРии еАнтибиотикосодержащий агар ВН 1 готовят за 1 сут до применения. Дляэтого к 100 мл расплавленного остуженного до 45-50 С агара ВН 1 добавляоют необходимое количество рабочих стерильных растворов антибиотиков, тщательно перемешивают и разливают в сте рильные чашки Петри (диаметром 100 мм)по 20+2 мл и хранят при 4 + 1 С добприменения,Клетки штаммов Ь, шопосуйояепез 766(1 а серовар) и 1196 (4 Ь серовар) выращивают в течение 18+2 ч в 5 мл среды ВН 1 при 37+2 С,.затем осаждают их10-минутным центрифугированием при6000 а, ресуспендируют в 0,5 мл стерильного физиологического раствора иравномерно распределяют по поверхностиагара ВН 1 в чашках Петри. Через 2030 мин в центр чашки наносят 20 мклраствора стрептомицина, т.е. 100 мкгантибиотика, Чашки инкубируют при37+2 С в течение 20-24 ч. Выросшие во 35зоне накапывания стрептомицина колонии, устойчивые к данному антибиотику,отбирают стерильной петлей, высеваютв 5 мл бульона ВН 1, содержащего100 мкг/мл стрептомицина, и выращивают в течение 18-20 ч при 37+2 С.Затем клетки осаждают 10-минутнымцентрифугированием при 6000 я, ресуспендируют в Ор 5 мл ФСБ Раствора и 45равномерно распределяют по поверх ности агараВН 1,содержащего 100 мкг/млстрентомицина. Через 20-30 мин в,:центр чашки с агаром накапывают4 мкл раствора канамицина (20 мкг),после чего чашки инкубируют при37+2 С 18-20 ч.Выросшие в зоне накапывания канамицина колонии высевают в 5 мл ВН 1бульона, содержащего 100 мкг/мл.стрептомицина и 20 мкг/мл канамицина.55Описанную операцию повторяют ещераз, повьппая концентрацию канамицина, до 50 мкг/мл, Колонии, выросшие на агаре ВН 1, содержащем 100 мкг/млстрептомицина и 50 мкг/мл канамицинаизучают под микроскопом и определяютразмер (длину) клеток по известномуметоду. Мутантные стрептомицин-кана"мицинустойчивые клетки длиной 2-4 мкмотбирают и определяют их пятидесятипроЦентную"летательную дозу (ЛДпо)при внутрибрюшинном заражении мьппей.Соответствие размера клеток (длины)и их вирулентных свойств (ЛДо) приведены в табл. 1 и 2. Результаты про-.веденных исследований приведены втаблицах 1 и 2. Связь вирулентныхсвойств (ЛД, ) и размера (длины) мутантных стрептомицин-канамицинустойчивых клеток листерий приведена втабл, 1.Как видно из табл, 1, установленазависимость между размером клеток ивирулентными свойствами мутантных антибиотикоустойчивых штаммов: клеткислабовирулентных мутантных клонов в2-3 раза превышают размер клеток ис-ходного вирулентного штамма.Влияние сочетания антибиотиковстрептомицина и канамицина на вирулентные свойства мутантных штаммовлистерий приведено в табл. 2,Таким образом, результатами исследований показано, что используя сочетание антибиотиков стрептомицина иканамицина в концентрации 100 и50 мкг/мл соответственно, а также направленный отбор слабовирулентных мутантных клонов Ы чхго микроскопиейпо размеру клеток, можно без большихзатрат в более короткий срок получитьклоны листерий с 1000-кратно ослабленной вирулетностью. Формула и з о б р е т е н и я, Способ селекции слабовирулентных клонов листерий, включающий выращивание биомассы исходного. штамма. высев ее на содержащие антибиотик среды,выделение антибио тикоустойчивых мутантов и отбор слабовирулентных клонов,о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью снижения вирулентности клонов за более короткий срок, биомассу исходного штамма выращивают на среде, содержащей 100 мкг/мл стрептомицина и 50 мкг/мл канамицина а отбор клонов проводят по размеру клеток, при этом длина отобранных клеток должна превы,.шать длину клеток исходного вирулент ного штамма в 2-3 раза.(0,0 1,1+О,ИсходныйМутантныестре птоми 2 01 01 а блица Штамм 1 шопсусонепез фе но типиче ская характеристикаштамма ент" и внутри- брюшинном заражении мышей,766 Исходный1,0 х 10 8 э Зх)0 2,3 х 10 1,7 х 10 Яш КшЯЙш" 100.Кш" 50Яш100Кш 50 Мутанты1196 Исходный Мутанты ЯСш Кш5 Яш" 100 Кш" 50 3,8 х 104,0 х 108 римечание Ять к антибиотику;устойчивость к антиби- стрептомицин;- канамицин; ствительноК - Ясш тик 100 и 50 концентрация дан биотика, мкг/мл,ан цин-к анами- цинустойчивые клоны1 2,5+0,3 1,8+0,2 1,8+0,3 2,0+0,3 2,0+0,2 1, 9+0,2 2,5+0,3 1,9+0,2 с.0,01 сО, 01 сО, 01 с.О, 05 с 0,01 с 0,01 Вирулентность при внутрибрюшинном заражении мышейЛд 0 1,5 х 10 6,0 х 10 8,3 х 10 1,5 х 107 1,1 х 1010 1,1 х 10 9,5 х 10