Способ определения катехоламинов в биологическом материале

(51) 4 О 01 И 33/48 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Горьковский государственный медицинский институт им. С.М.Кирова(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАТЕХОЛАМИНОВ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ (57) Изобретение предназначено для исследования физических и химических свойств биологических веществ и для экспериментальных и клинических исследований обнаружения и количественного огределения биологически активных соединений - адреналина, норадре" налина и дофамина. Цель изобретения - ускорение и повышение точности анализа путем снижения потерь катехола.минов в процессе обработки биологического материала. Для этого навеску ткани (100-250 мг) перетирают на холоду (4 С) в стеклянном гомогенизато 801302194 А 1 ре в растворе 0,1 н. хлорной кислоты, центрифугируют (4000 я, 15 мин), Супернатант сливают, осадок вновь гомогенизируют, перемешивают с такой же (5 мл) порцией 0,1 н. хлорной кислоты и обрабатывают с помощью ультразвукового дезинтегратора (150 Вт, амплитуда 1 О мкм) 2 мин. После повторного центрифугирования (4000 я, 15 мин) супернатанты объединяют, смешивают с окисью алюминия (0,5 г) в стеклянном стакане (на 20 мл) прио4 С. Смесь переносят на бумажный фильтр, вакуумным отсосом кислоту удаляют, осадок промывают, высушивают под вакуумом, вносят вместе с фильтром в пробирку с гексаметилдисилазаном (1,5 мп) так, чтобы уровень последнего был выше уровня окиси алюминия, добавляют 10-20 кг сульфата аммония, кипятят с обратным холодильником, реакционную смесь перегоняют под вакуумом, упаривают до 50 мкл при 160-170 С,:проводят газовую хроматографию с ионизационно-пламенным детектором. Ошибка способа не превышает 37.Изобретение относится к исследованию химических и физических свойств биологических веществ и может быть использовано в экспериментальных и клинических исследованиях для обнаружения и количественного определения биологически активных соединений - адреналина, норадреналина и дофамина.Целью изобретения является ускорение и повышение точности анализа за счет снижения потерь катехоламинов в процессе обработки биологического материала.Способ осуществляют следующим образом.Навеску ткани 100-250 мг перетирают на холоду (4 С) в стеклянном гомогенизаторе в растворе 0,1 н. хлорной кислоты объемом 5 мл, центрифугируют (4000 об/мин, 15 мин). Супернатант сливают, осадок вновь гомагенизируют, перемешивают с новой порцией 0,1 н. хлорной кислоты (5 мл) и подвергают обработке с помощью ультразвукового дезинтегратора (150 Вт, амплитуда О мкм) в течение 2 мин, После повторного центрифугирования (4000 об/мин, 15 мин) супернатанты объединяют, смешивают с окисью алюминия (0,5 г) в стеклянном стакане (нао20 мл) при 4 С и перемешивают в течение 30 мин. Смесь переносят на бумажный фильтр, помещенный на стеклянном фильтре Шотта, с помощью вакуумного отсоса кислоту удаляют, осадок промывают дистиллированной водой (10- 15 мл), высушивают под вакуумом, вносят вместе с бумажным фильтром в пробирку с гексаметилдисилазаном (1,5 мл) таким образом, чтобы уровень гексаметилдисилазана был выше уровня окиси алюминия, добавляют сульфат аммония (10-20 мг), кипятят 15-30 мин с обратным холодильником при 130-160 С, реакционную смесь перегоняют под ваокуумом при 140-,150 С и упаривают при 160-170 до 50 мкл, после чего прооводят газовую хроматографию с ионизационно-пламенным детектором на трехметровой стеклянной колонке с внутренним диаметром 3 мм, заполненной хроматоном (0,125-0,160 мм) + 5% Епри температуре испарителя 230 С и термостата колонок 210 С.П р и м е р 1, Навеску надпочечников собаки 150 мг перетирают на холоду (4 С) в стеклянном гомогенизаторе в растворе 0,1 н. хлорной кислоты (5 мл), затем центрифугируют15 мин при 4000 об/мин. Супернатантсливают, осадок вновь центрифугируют,перемешивают с новой порцией кислоты 5 (5 мл) и подвергают обработке с помощью ультразвукового дезинтегратора(150 Вт, амплитуда 1 О мк) в течение2 мин. После повторного центрифугирования (15 мин при 4000 об/мин) супернатант переносят к первой порции кислоты. Объединенную смесь кислот смешивают с окисью алюминия (О 5 г) приоФ4 С и перемешивают в течение 30 минстеклянной лопаткой или миксером при100 об/мин. Окись алюминия с кислотой количественно переносят на бумажный Фильтр Шотта. С помощью вакуумного отсоса кислоту удаляют, а окисьпромывают дистиллированной водой (1015 мл). Высушенный под вакуумом порошок окиси алюминия вместе с бумажнымФильтром переносят в пробирку с гексаметилдисилазаном (1,5 мп) и 15 мгсульфата аммония (катализатор), затем кипятят с обратным холодильникомопри 145 С в течение 25 мин. По истечении этого времени проводят вакуумную перегонку при 145 С. Полученнуюжидкость упаривают до 50 мкл прио165 С и провоцят хроматографическийанализ в стандартных условиях,П р и м е р 2, Навеску надпочечников собаки в количестве 150 .мг перетирают при 4 С в стеклянном гомогежзаторе в 5 мл 0.,1 н. раствора хлорной кислоты и проводят операции какв примере 1 До этапа кипячения гексаметилдисилазана с катехоламинами,сорбированными на окиси алюминия. Затем условия меняют следующим образом.Смесь кипятят с обратным холодильником при 130 С 15 мин. По истеченииэтого времени проводят вакуумную перегонку при 140 С. Полученную жидкость упаривают при 160 С до 50 мкли проводят газохроматографическийанализ в стандартных условиях. П р и м е р 3. Навеску надпочечников собаки в количестве 150 мг переотирают на холоду (4 С) в стеклянном гомогенизаторе в 5 мл раствора (О 1 н) хлорнои кислоты и ПООВОдят операции, как в примере 1,цо этапа кипячения гексаметилдисипазана с катехоламинами, сорбированными на окиси алюминия. Затем условия меняют следующим образом.1302194 Составитель Н, ГуляеваРедактор О. Юрковецкая Техред И.Попович Корректор Л.Патай Тираж 777 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 13035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Заказ 1212/44 Производственно-полиграфическое предприятие,. г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Смесь кипятят с обратным холодильником при 160 С 30 мин, проводят вакуумную перегонку при 150 С. Полученную жидкость упаривают при 170 С до 50 мкл и проводят газохроматографи ческий анализ в стандартных условиях.Ошибка способа не превышает 37.,Формула изобретения 10 Способ определения катехоламинов в биологическом материале путем гомогениэации исследуемой пробы в хлорной кислоте, центрифугирования сорбции катехоламинов супернатанта на окиси алюминия, упаривания и получения силиловых эфиров катехоламинов при обработке гексаметилдисилазаном с последующей газовой хроматографией, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что с целью ускорения и повышения точности анализа за счет снижения потерь катехоламинов в процессе обработки биологического материала, перед нанесением супернатанта на окись алюминияпроводят ультразвуковую дезинтеграцию осадка в хлорной кислоте, повторно центрифугируют, супернатанты послепервого и второго центрифугированияобъединяют, смешивают с окисью алюминия, которую затем высушивают подвакуумом на бумажном фильтре, помещенном на стеклянном фильтре Шотта,и вносят вместе с бумажным фильтромв прббирку с гексаметилдисилазаномтаким образом, чтобы уровень гексаметилдисилазана был выше уровня окисиалюминия, добавляют сульфат аммония,выдерживают при 130-160 С в течение15-30 мин, затем реакционную смесьперегоняют под вакуумом при 140150 С и упаривают при 160-170 С, после чего проводят гаэовуюхроматографию.