Способ определения цистеин-содержащих белков

19) Я 13 3 4 5114 а О ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ НИЯ ОПИСАНИЕ ИЗ ЕТ ЕТЕЛЬСТ К АВ ГОРСКОМ 1366/28-1412.8304.87. Бюл. Утовский госудаим. М.А. СусСиничкин, Вумряков.015(088.8)1 у 1 са 1 ВосЬ51, У 2, р. СТЕИНСОДЕ 13 ки разрственныи ун и погруый рауют випящей А. Лепехин Ыт,гу 6-469 щерсусщем Ю(21) 367 (22) 08. (46) 07. (71) Рос верситет (72) А.А и Б.И. С (53) 612 (56) Апа 1973, ч,СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИЖАЩИХ БЕЛКОВ 57) Для упрощения способа бе еляют диск-электрофорезом в криламидном геле, затем гели ают на 8-12 мин в 6,9-10,97- вор плюмбита калия и инкубир ом же растворе 8-12 мин на к одяной бане, Для фиксации ок охранения структуры гелей их ивают 12-18 мин в 5-10%-ной ой кислоте и помещают в глиц ели денситометрируют в прохо вете. 1 табл.Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для определения цистеинсодержащих белков при электрофорезе в полиакриламидном геле. 5Цель изобретения - упрощение способа за счет сокращения числа стадий.Способ осуществляется следующим образом.Анализируемые белки разделяют10 диск-электрофорезом в полиакриламидном геле, затем гели извлекают из трубок и погружают на 8-12 мин в 6 9-10 97.-ный раствор плюмбита калияо15 после чего в том же растворе инкубируют 8-12 мин на кипящей водяной бане. При этом в зонах цистеинсодержащих белков проявляются черные полосы сульфида свинца. Для Фиксации окраски и сохранения структуры20 гелей их выдерживают 12-18 мин в 5-107-ной уксусной кислоте и помещают в глицерин. Через 24 ч глицерин необходимо сменить. Для длительного25 сохранения окраски гели хранят в герметически закрытой посуде в глицерине в прохладном темном месте.П ри м е р 1. Приготовление аналитического реагента для идентификации цистеинсодержащих белков раствора плюмбита калия.К 107-ному раствору ацетата свинца постепенно приливают при перемешивании насыщенный раствор едкой щелочи (КОН); При этом выпадает белый осадок гидроокиси свинца, Щелочь приливают до полного растворения осадка. Вместо ацетата свинца можноиспользовать другие растворимые в воде соли свинца, а вместо едкого калия - едкий натр,Идентификация индивидуального цистеинсодержащего белка, а именно сывороточного альбумина быка, при разделении диск-электрофорезом в полиакриламидном геле,5 мкл водного раствора, содержащего О мкг сывороточного альбуминабыка, подвергают диск-электрофорезув 7,57.-ном полиакриламидном геле.Для диск-электрофореза используютстеклянные трубки с внутренним диаметром 3 мм и длиной 70 мм. Последиск-электрофореза гели извлекают из55трубок и помещают в раствор плюмбитакалия на 10 мин при комнатной температуре, затем в том же растворе гелиинкубируют 10 мин на кипящей водяной бане, ополаскивают дистиллированной водой, выдерживают 15 мин в 77,-ной уксусной кислоте и помещают в глицерин, При этом в гелях появляются черные полосы в зонах альбумина и его димера. Гели денситометрируют в проходящем свете на микроденситометре,Построение калибровочной кривой.Для определения количества цистеина в зонах цистеинсодержащих белков строят калибровочную кривую по сывороточному альбумину быка. Для этого подвергают диск-электрофорезу образцы, содержащие соответственно 10,20, 40,60,80 и 100 мкг сывороточного альбумина быка После диск-электрофореза гели обрабатывают, как описано. После денситометрирования гелей денситограммы вырезают и обрабатывают гравиметрически. Зная количество альбумина в образцах и содержание в альбумине цистеина (5,177), строят калибровочную кривую, отражающую зависимость массы денситограмм от количества цистеина в зоне. По калибровочной кривой можно определить количество цистеина в зонах цистеинсодержащих белков, а также количество самих белков, если известно содержание в них цистеина.П р и м е р 2. Индентификация цистеинсодержащих белков сыворотки крови крыс при диск-электрофорезе в полиакриламидном геле.5 мкл сыворотки крови крыс подвергают диск-электрофорезу в7,5%-ном полиакриламидном геле, После диск-электрофореза гели обрабатывают, как описано. После денситометрирования гелей денситограммы вырезают и обрабатывают гравиметрически. Цистеинсодержащие белки индентифицируют в зонах альбумина, гемоглобина и иммуноглобулинов в виде интенсивных черных полос, По весу денситограмм при помощи калибровочной кривой определяют содержание цистеина в зонах и количество альбумина в образце. В таблице представлены данные, отражающие содержание цистеина в зонах цистеинсодержащих белков сыворотки крови крыс.Согласно полученным данным содержание мономерной формы альбумина в 5 мкл сыворотки крови крыс составляет 42 мкг или 840 мг 713021 Гемоглобин т-глобулиАльбумин Показатели ны Масса денситограмм, мг 9,2 1,4 4,1 Масса цистеина в зонах, мкг 0,52 2,12- 15 формула изобретения Составитель Н.ГуляеваРедактор О. Юрковецкая Техред И.Попович Корректор С. Шекмар Заказ 212/44 Тираж 777 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Подлисное Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 П р и м е р 3. Определение оптимальных режимов обработки гелей.Оптимальный диапазон концентраций плюмбита калия в растворе составляет 6,9-10,97. Масса площади пика денси тограммы для эоны альбумина,нанесенного в количестве 40 мкг на гель при обработке раствором плюмбита калия в концентрациях .6,9; 8,6 и 11,9 Е, составляет соответственно 9,2+18; 25 9,0+0,20; 9,1+0,23 мг.Выдерживание геля в растворе плюмабита калия при 25 С оптимально в течение 8-12 мин. Масса площади пика на денситограмме 1,40 мкг альбумина 30 на гель) при,инкубации геля в тече 95 4ние 8,10 и 12 мин при 25 С составляет соответственно 7,0+0,12; 7,0+0,14 и 7,1+0,15 мг (значения при отсутствии дальнейшего выдерживания на кипящей водяной бане). Выдерживание геля в растворе плюмбита калия при кипячении на водяной бане оптимально в течение 8-12 мин. Масса площади пика на денситограмме (для 40 мкг альбумина на гель) при инкубации геля в течение 8, 10 и 12 мин при кипячении на водяной бане составляет соответственно 9,0+0,2; 9,1+0,2 и 9,1+0,25 мг. Способ определения цистеинсодержащих белков путем разделения анализируемых белков диск-электрофорезом в полиакриламидном геле с последующей обработкой геля окрашивающим реагентом и денситометрированием, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа за счет сокращения числа стадий, в качестве реагента используют плюмбит калия в концентрации 6,9-10,9 й,выдерживают гель в этом растворе 8-12 мин, а затем 8- 12 мин на кипящей водяной бане.