Рекомбинантная днк и способ ее получения

СОК)З СОВЕТСНИХСО.1 ИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН М 15/00 1) 4 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ЙИ,Л;г:ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 8 и сайта связывания рибосом 80) с воз можностью продукции н трансформированных ею бактериях Е. сог М 103 гибридного белка, проявляющего интерферонсподобное антивирусное действие и ферментативную активность.2. Способ получения рекомбинантнсй ДНК М 3101112 путем слияния полинуклеотида, кодируюп 1 его аминокислотные остатки 8-146-галактоэидадь 1, и гена интерферона, клонированнсго в составе векторной ДНК фага М 13 гпр 8) о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью обеспечения единой непрерывной фазы трансляции слитных генов, из ДНК М 13 гпр 8 БР 02112 удаляют полинуклеотидную последовательность, содержащую сигнал прекращения трансляции ТАС - гена интерферона .грпутем ферментативного расщепления ДНК М 13 гпр 8 БР 2 Б 2 по сайтам РБМК и последующей лигазной сшивки концов ДНК с помощью ДНК-лигазы Т 4 с образованием циклической кольцевой ДНК М 13 й био.И.ТатькИльичев 6,63.983,дегп. 1981,а 1. Вев, а 1. 1. Вее 84 ОБ ЕЕ 131 СЬ слотн ве идадь е п рВГ 112. ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРпО делАм изОБРетений и ОтнРьгтий(57) 1. Рекомбинантная ДНК Мсодержащая полинуклеотиды, кющие последовательно аминокиостатки 1-158 Л интерферонака и остатки 8-46 11-галактоЕ. со 11, трансляционно слитьгконтролем промоторов р 1 ас)Изобретение относится к медицине, а именно к молекулярной биологии и генной инженерии.Цеггью изобретения является обеспечецие единой непрерывной фазы трансляции слитных генов эа счет того, что направленно исключают из ЛНК М 13 гпр ЯЯР 0212 полинуклеотидцую последовательность, содержащую сигнал прекращения траггсляпии ТАС геца 4 ицтерферона и обеспечивают совпадение фазы трансляции гецов- ицтерфероца и,1-пептида-галактозидаэы.Рскомбицантцая ЛНК М 3 1 СЗ 112 содержит полицуклеотидьг, кодирующце последовательно амцнокислотные остатки 1 в 1 г ицтерфероца человека и отатки 8-146 Р - галактозидазы Е. со 1 г трацсляпиоццо слитые под контролем промоторов р 1 ас., РЯР 02 и сайта связывания рибосом 60.Гпособ осуществ:гяют следующим образом,1 О1520 Лвухпеггочечную кольцевую форму25 ДНК М 3 щр ЯЯР 0232 подвергают гидро- лизу с помощью зндонуклеазы Ряг 1 Последняя расщепляет ЛНК по сайтам Рз 1 в результате чего образуются два Фрагмента ЛНК, резко отличающиеся по молекулярному весу. Смесь оббарабывают ЛНК-лигазой Фага Т 4, которая обеспечивает ковалентное соединение концов линейной ДНК и образование гиклической двухцепочечной ЛНК, Лля отделения ЛНК, которая при обработке лигазой захватила малый Рв.-РяГ Фрагмент, смесь обрабатывают рестриктазой Яа 1 СТ, Полученцым препаратом трансфипируют бактерии Е. со г,103 обычггым способом и от О бирают к.чоцы бактерий, которые способны образовывать колонии на твердом агаре, окрагщцваемые в голубой или синий цвет в присутствии хромофорцого субстрата р -галактоэидаэы45 5-бром-индоксил-В-галактопираггозида (г-Га), Клоны иггфицгрованных бактерий размцожают, отделяют обычным способом бактериофаг и выделяют из него однопепочечцую кольцевую 50 ДНК, ЛНК анализируют с помощью элект. рофореза в агарозе и отбирают препараты, подвижность которых в геле не отличается заметно от подвижности исходной ЛНК М 13 щр ЯЯР 02 И 2. Из бак терий Е, со 11,1 М 103, трансформированных этими препаратами ЛНК, выделяют двухпепочечную кольцевую ЛНК. г.труктуру ЛНК, в которой отсутствует полинуклеотидная последовательцость, содержащая сигнал прекращеггия трансляции ТАС гена ицтерферона / доказывают методами рестрикпионного анализа. Так, при гидролизе полученной ЛНК рестриктазами РяС 1 и Есор получают Фрагменты ЛНК, соответствующие длине 284 и 498 пар нуклеотидов, обнаруживаемые при электрофорезе в 67-ггом полиакриламидном геле и идентифицированные гго длине в сравнении с э талонггьгм Вар - гидролиз атом ЛНК рВК 327. Рестриктаза Есор гидролизует 1 НК с образованием фрагмента длиной 284 пары нуклеотидов, В отличие от исходной ЛНК М 3 гпр ЯЯР 02 Х 2 в полученной ЛНК М 13 1 ГЬ 12 отсутствует участок, боклюгающигг сайт узнавания рестриктазы Ба СТ ца что указывает устойчивость ДНК к действию этой регтриктазы. 0 том, что 11 НК М 13 СЬ 12 содержит трацсляпиоццо слитные гены Г -интерфероца иЫ -пептида-галактозидазы, свидетельствуют также данные биохимического анализа продукта экспрессии этих генов в бактериях-гибридного белка, обеспечиваюпгего фермецтативную активность-галактозидаэы.П р и м е р. Лвухцепочечную кольцевую ЛНК МЗгггр ЯЯР 0212 выделяют из штамма бактерий Евс 1 гегсЬа со.1. ,гп 103, трансформированных этой ДНК и очищают пентрцфугированием в градиецте плотности хлористого ггезия.Гоответствие ЛНК приписываемой структуре подтверждают анализом продуктов Фермецтативного гидролиза ЛНК рег триктазами ЕсоК 1 Рв 1 и Ба 1 С 1, Продукты гидролиза, фрагменты ЛНК разчичцой протяженности, идентифицируют по их подвижггости в 67,-ггом полиакриламидцом геле в сравнении с зтаггоцными фрагментами Вэр 1 - гидролизата плазмиды рВ 1 321, Наблюдают образование фрагментов длиной около 300 и 500 пар цуклеотидов (п.н.), что соответствгет следующей ожидаемой схеме гилролиза: ЕсоВ 1.284 гг,н.; Есор+Рвг 1-36 п.ц. це прокрашивается) 284 п.н., 498 п.ц ЕсоК 1+Ба Г 1 284 п.ц 523 п.н,Слияние генов интерфероца и ы -пептида 13 -галактоэидазы осуществляют следующим образом, Очищенную и охарактеризованную ДНК М 13 щр ЯЯР 0252 (2 г мкг) обрабатывают рестрикта25 с):,5 4тсдтстсгнс о-нитрофгнит-гялдктоэидл. Для2 7 и 2 ст клонов трдтсгформирсс вдтсньтхблктгтссЙ тсдблюдлнт вьтгокиЙ уровенЬтскттстстсосттс,с -галдктозиллзы (1, 1 -,1 слlмтт) . 1 Итоковьсе рдгтворы флгов( и50 .;к.с ) из клс тсотс, лемоцстрирунсщих выс окий уровс цт сс-т длтктоэттдлзцой дктивцогти, испсльз пст Лпя ицфи;:иротслция бактерии Е. го 1 г,1 С 10310 (; о 500 мкл цочцой культуры). Послессс 1 сстттсровлтстся пробы рдзблвпянст 40 млгрлы УТ. лоблв,тяют ИПТГ ло коцценпрлтпси 10М и ицкубирун т при кдчд 1цтцс 5,5 ч при 35 Г, Клетки осаждаютцецтрифугировднием, разрушают путемттогпелснательной обработки лиэоцимому-ц.трлзвуком и опредегтяют в лизатдх днтивиругцую интерфероцополобнуюдктивцость извес тць;.с гпособом, Одноврсссццо в клетках и их лиздтах опрелглсснст ферментативную лктивтсость)З -с л.с;,зктоттлдзы. Отбтсрлют клон, назван 1сми клон 12, демонстрирунспгтсй самыйтстс окий уровень дцтивирусцой активтсогстс (407 от коцтрольцого щтдммаГ. со 1 г,ГМ 103, трдтсгформттротлтттсогорекомбиндцтной ДНК ,113 тпр 8 БР 021 с 12)и ферментлтивной активности, Из бактсртсдлттсоЙ массы этого клсьнд вьтттелян . лтсухцепочечную конт цевую НК, цазвдтстсую М 13 1 С"п 112, структуру котор с. подтверждают Ллццые лтсдстизс прод;втоц ге гидролизя рестриктдзлмиЕсоК 1, Ряс 1 и Бл 1 (1,Вт,слеляют такжетс с блктс риофаг а опцоцепочс исунс ДНК, 35которую хлрлктеризунт по злектрофорс тцчегкой подвцжцости в геле аглросы при срлвнеции с коцтро.сьцьпяс обр,сзст тмтс ЛНК рдэличссой ллинь (М 13 гпр 1,М 13 пр ЯБР 02 Г)2) . При гидрости сс лвухцепс чсчцой,т 1 НК М 13 1",Гт 112 получаютг:тедующие фрагменты, идецтифицировлнцыс по подвижности в 6 ном полиэой Рвс 1 (200 ед.) до полного гидролизд ЛНК, контролируемого с помощью электрофрезл в 17,.-ттоьс лгарозе, Белок отделяют фенольцой экстрдкттией и осаждают ЛНК зтднолом, Отделенную 1 В 1 К полвергдн.т спигдзной свивке с помощью 1 НК-лиглзтт 14 при 10 С в течение 17 ч, после чего смесь прогреовают 15 мин при 65 Г и обрабатывают рестриктазой Ба 1 (1. Погле ицдктиватии фермента прогреванием при 65 С в течение 15 миц пробу анализируют злектрофорезом в 17-ном дглрозе и убежланстся в том, что линейная двухцепочечцая ДНК преврдтипась в кольцевую ДНК, не отсттстлюптуюгя цо тсолвижногти при злгктрофорс де ст ДНК М 13 тпр 8 БРОЮ 2 или лрутих прои стсогтных ДНК фага М 13 бпизкого рлзнсерл.Гтолученным препаратом ГП 1 К 50 мкл трацгфицируют прелвлрите,пьцо обрлботдттчые хлоригтым кдгп,ттиет. клетки Е. го Гт ХМ 03 и тцсгсвлн.т их нд твердый агар, содерждщссй итсдуктор- галактозидазы тсзопропгспттссс-,1-Г)-гдстдктопирлнозил ( ИПТ с и хромофорцьпс у субстрат Г) -тллдктозиддзы 5-бром - инлокгил-3-1)-гдлстктоттирднссзтсгт (У-Са 1), Пос сс сссск бдции чащек с агаром при 37 Г в течецие 16 ч наблюдают обрдэовдцие ца них 29 негативньгх колоний, окрашенных в бледно-синий цвет, В коцтрольцом зкспери. менте при трднсекции бактерий исходной ДНК М 3 щр 88 Р 02 И 2 образуются неокрашенцые негдтивцые колонии, Все полученные колонии переносят петлей в конические пробирки, содержащие по 1 ьсп питателт,цой среды УТ, и инкубируют гмеси при 37 "С при помешивании, Через 7 ч в кджлунс пробирку вносят по 5 мкл 100 м ИГ 1 ТГ и оставляют их при 37 С на ночь. Клетки осаждают иентртсфугированием, супернагантьт переносят в чистые пробирки, 45 добавляют в каждую из них гто капле хлороформа, закупоривают и оставляют храниться тсри 8 С, игполь суя в качестве щтокоцого раствора бактериофдгд для инфицирования, стсадок клеток в каждой пробирке ресуспендируют в 1 мл буферцот о рдсттссра 7 и определяют актшттсость д - галактоэидазы общепринятым методом с использоТирдж 490 Подписное г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ВНИИПИ Заказ 4377/21 Произв.-полигр. пр-тие,льритлмидцом геле в грдвцеции с этдлснцымн фрагментами Вяр 1-гидролиэдтд г.лязмильс рВК 327: ЕгоК 1-284 парынуклгопилов (п.ц.); ЕсоК 1+Рвгг в 2г. сс., 498 пн. От исходной ПНК М 13 гпр88102.12 получешцпс препарат отличае . Гл гтоЙчсс тсогг ьтп к ЛгЙ гтнию регтриктдэы Ба 1 Г 1, что укдзьсвдет нд отсу;ствие в ней последовдтельцогти