Способ выявления иммуноактивных объектов

.ЕКурочкин 8) ельство СССР 1/04, 1983, ЬР Сл ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТ А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 54) (57) С 1 зОСОВ ВЫЯВЛЕНИЯ И 11 УНОАКИВНЫХ ОБЪЕКТОВ, путем создания ульразвукового поля в камере исследования и последовательного заполнения ее суспензией иммуносорбентов, про бой исследуемой жидкости, буферным раствором, раствором иммуноглобулина и второй порцией буферного раствора и регистрации сигнала излучения иммуноактивного объекта после прекрашения деистния ультразвуковогополя, о т л и ч а ю ш и й с я тем,что, с целью снижения расхода иммуоглобулинов и иммуносорбентов и сокрая времени проведения исследования, после заполнения растворомммуноглобуна камеры исследованияпротекание раствора останавливаютна 1-3 мин, создают в камере возвратно-поступательное движение раствора иммуноглобулина с амплитудойдвижения, равной 0,5 длины волныультразвукового поля, а после восстановления протекания раствора и введения второй порции буферного растворадважды проводят регистрацию сигнала Жизлучения иммуноактивного объекта привоздействии ультразвукового поля ипосле прекращения действия ультразвукового поля и осаждения иммуносорбентов.1 О 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Изобретение относится к технике выявления иммуцодктивцых объектов цд иммуносорбецтах с помощью иммуногпобулицов, конъюгировдццых с метчикдми, и может быть использовано в медицине, микробиопогии, экологии для экспресс-выявления иммуноактивных объектов.1 ель изобретения - снижение расхода иммуцоглобулинов и иммуносорбецтов и сокращение времеци проведения исследовация,На чертеже представлена схема,реализующая способ.Способ основан на постановке серологической реакции нд иммуцосорбентах в ультрдэвуковом поле и выявлении иммуцоактивцых объектов путем регистрации сигнала от связанных с выявляемыми объектами меченных иммуцоглобулицов,Способ осуществляется следующим образом.Создают ультразвуковое поле и в поток жидкой среды пропускают через него суспецэию иммуносорбентов, При этом иммуносорбецт под действием силы радиационного давления ультразвука удерживается в слоях в ультразвуковом поле. Здтем пропускают через ультразвуковое поле исследуемую пробу. Выявляемые иммунодктивные объекты с потоком жидкой среды проходят через слои, образонанные иммуносорбецтом в ультразвуковом поле, и вступают с иммуносорбецтом в серологическую реакцию.Далее через ультразвуковое поле пропускают буферный раствор, который вытесняет из ультразвукового поля жидкую среду исследуемой пробы, После этого в ультразвуковое поле подают раствор меченных иммуноглобулинов, После того, как растнор меченных иммуноглобулинов вытеснит иэ ультразнукового поля буферный раствор поток жидкой среды остацанливают и выдерживают смесь иммуносорбентов и меченных иммуноглобулинов -3 мин. В процессе выдержки циклически, возвратно-поступательно перемещают раствор меченных иммуноглобулинов на 0,5 длины ультразвуковой волны. Поскольку ультразвуковое поле удерживает иммуносорбент в слоях, отстоящих друг от друга на 0,5 длины ультразвуковой волны, то заданное перемещение раствора мс ч ццых имму. цо лобулинон достаточно для полного омывация иммуцосорбецтов раствором.В процессе выдержки меченные иммуцоглобулины вступают в серологическую реакцию с выявляемыми иммуцодктцвными объектами, фиксированными на иммуносорбентдх, После выдержки пропускают через ультразвуков е поле буферный раствор, который вымывает меченные иммуцоглобулицы, не вступившие в серологическую реакцию, Затем вначале регистрируется информативный сигнал, не включая ультразвуковое поле, а повторную регистрацию проводят после включения ультразвукового слоя и осаждениИ иммуцосорбентов на нижнюю поверхность полости камеры исследовдция.П р и м е р 1, Выявляют риккетсии О. нЬггсиэ, В камере (объемом 0,025 см ) создают ультразвуковое поле (частота ультразвуковых колебаний 2,6 мГп, средняя плотность энергии поля 3 Дж/м и последовательно пропускают через ультраэнуковое поле 107.-ную суспензию сефароэного иммуцосорбентд, суспецзию риккотсий Р. нгЬдгдсцн фосфатный буферный раствор, а затем подают в камеру флуоресцирующие иммуцоглобулины, гомологичные к Р, вЬдгсцн,останавливают поток жидкой среды и в течение трех минут циклически, возвратно-поступательно перемешают раствор по камере ца 0,5 длины ультразвуковой волны. После этого пропускают через камеру буферный раствор и регистрируют специфическую флуоресцеццию от иммуносорбецтов, находящихся н ультразвуковом поле.Время выявления 6 мин, Расход ингредиентов, см: сефарозный иммуносорбент 0,05; суспензия риккетский 0,2, флуоресцируюшие иммуноглобулины 0,03, фосфатный буферный раствор 0,3П р и м е р 2, Выявляют антигены Гг. сц 1 агепсе.В камере (объемом 0,026 см ) создают ультразвуковое поле (частота УЗ колебаний 2,6 мГц средняя плотность энергии поля 3 Дж/м) и последонательно пропускают через ультразвуковое поле 107-ную суспецзию сефароэного иммуносорбента, антигены, фосфатно-буферный раствор, а затемподают в камеру флуоресцирующце иммуцоглобулццы, гомологичцые к Рг.ГН 1 агепсе останавливают поток жидкой среды и в течение 3 миц перемещают иммуцосорбенть в камере цд0,5 длины ультравуковой влць путем колебания гранины раздела Фдзжидкость - воздух в открытом конце нъе днтитслд в крол)с 1 своротке,В камере (объемом 0,025 ссоздают ультрдзвукОВОе посе 1 дстотдультразвуковых колебдций 2 Г ми,СРЕДНЯЯ ПЛОтНОСтЬ знс.РИИ ПО.Я 6Дж/м ) и последовдте.ьно пропускдктчерез ультразвуковое по.е 3,-цуюсуспензию эритронит,зрцого дидгцостикума, кроличью гыворстку, Аосфдтнобуферный раствор, д затем полают вкамеру ацтикроли ьи Фуоресц 1 рующие иммуцоглобу.ппы. ОстсНсвливаютпоток жилкой среды и в течение трехминут циклически возвратно-поступательно перемешдкт раствор по камерена 0,5 длины упьтрдзнуковой волцы,После этого пропускают ерез камерубуферньй раствор и регистрируют специфическую фсуорегцс пнис от эритроцитарных сорбецтон, цаходящи.,ся в 25 30 35 40 ультразвуковом поле,Получают, Время выявлеНя 9 инРасход ингредиентов, см ; суспензииэритроцитарного дидгцостикума 0,05;45кроличьей сыворотки О,1; флуоресцирующих ацтикроличьих иммуцоглобулинов 0,03 фосфдтцо-буферного раствора 0,3,В примерах скорость рдсхода сус пензии определяется экспериментдльд но и равна: пример 1-5 10 м /с; пример 2 - 3 10 м/с; пример 352 1 О м /с, Соответственно время пропускания суспензии иммуносорбентов 55 составляет: 10 с, 17 с и 25 с.Количество исследуемой пробы, требуемое для выявления в ней иммунокожуха.После этого пропускают через кдмеру буферный раствор и регистрируют спепифическук флуорсспепНю отиммуносорбентов, цдходящихся в ультразвуковом поле,Получают, Время ыявле;Ня 8 миц.Расход ингредиентов, сы: сефдрозцый иммуцосорбецт 0,05; суспензияантигецов Рг. гц 1 дгепс 0,2; фпуореспирующие иммуноглобулц, О,)1;фосфатно-буферный раствор 0,3,П р н м е р 3. Вмяв;яют бруцеллез.чиц приводит к повышению чувствитлности способа, тдк кдк припропускании исследуемой пробы иммуцодктцвные Обьекты КОнцентрируютсяд нзвешдццьгх в ультразвуковом поле1 к 9 у цосорбецгдх. Однако увеличениебъед пробы увеличивает и время выЯН:ЕНИЯ.В примерах соотцопецие объемов проб к объему камеры составляет соо.ветственно 8; 8; 4, При этом исОл,зовдлись пробы с концентрацией иммуцодктивных объектов нд пределе 1 вгтвительцости,1 уферный раствор используется для вытеснения из камеры жидкой фазы проциествующего ингредиента и про -пки иммуносорбецта. КоличествоГуферцого раствора зависит от объемаи геэ."етрии камеры (наличия в камере"дгтойных" зон) и составляет 3-15объсмог камеры,ОГъем раствора иммуцоглобулицдлолжец превышать объем камеры це мецсе, чем нд величину объема раствора,1;пс сняемого из камеры прц перемешив,ции в процессе выдержкит l + где 7 - объем раствора иммуцоглобулинд;объем камеры; объем раствора, вытесняемый из камеры при его перемещении в процессе выдержки. Объем вытесняемого рдстнора приео перемещении на 05,) составит Ъ =Я 05,1, 1где- объем вьтесняемого рдствора;Б - плосадь поперечного сечения камеры,В примерах=0,025=0,002 см ; 1 =0,03 см см дк гивных объектов, зависит от коппс итрдпии пробы и объема, в котором,льтрдэвуковым полем удержисдютсяцммуцосорбенты ОГ ъемд кдеры) . Обычи. ь оцпецтрдция иммуцодктцНых объектов в пробе не известна, поэтомукспериментд;ьно было установлено,что для обеспсчеция необходимой чув тНтельностц выявления, об 9 ем исследуемой пробы должен превьшдть объемкд.еры в 3-10 раз, Увеличение объемаРРГН относительно указанной Вели1250576 20 Составитель ф.РогоданскийРедактор П.Авраменко Техред О.Гортвай Корректор Е.Рошко Заказ 4377/21 Тираж 490 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва Ж, Раупская наб д, 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул, Проектная Устройство содержит датчик 1 информативных сигналов, регистратор2 сигнала и блок 3 измерений. Блок3 состоит из генератора 4 ультразвуковых колебаний, средства 5 подачи и средства 6 приема реагентови растворов, системы 7 термостатирования со средствами подачи и отбора охлаждающей жидкости и узел 8, 10содержащий держатель 9 с ультразвуковым излучателем 10, кожух 11, камеру 12, сборник 13 охлаждающей жидкости и узел 14 возвратно-поступательного движения раствора, установленный перед входом камеры 12. Кожух11 открыт с противоположного от держателя 9 торца и на нем установленакамера 12 так, что ее рабочий объеми зона чувствительности датчика 1пространственно совмещены, а зонамаксимальной чувствительности датчика 1 совмещена с нижней поверхностью полости камеры 12,В качестве датчика 1 для индикации и преобразования в электрический сигнал сигнала от иммуносорбентовиспользуют люминесцентный микроскопс фотометрической насадкой (при выявлении флуоресцентных метчиков), 30датчик радиоактивного излучения (привыявлении радиоизотопных метчиков),колориметрический фотометр (при выявлении ферментных метчиков) и друГие Для регистрации электрического сигнала используется самописец,вольтметр или цифропечатающие устройства,Ультразвуковая волна, возбуждаемая ичлучателем 10, распространяется в охлаждающей жидкости, омывающей камеру 12 и в жидкости в камере 12. Достигнув мениска охлаждающейжидкости, ультразвуковая волна отражается от границы раздела фаз жидкость - воздух. Вследствие кривизны мениска отражение происходит подразными углами к падающей волне. Врезультате интерференции падающей и отраженной ультразвуковых волн,проходящих через камеру 12, в нейобразуется поле стоячей ультразвуковой волны, Тепло, выделяемое излу.чателем 1 О и ультразвуковым полем,отводится охлаждающей жидкостью,омывающей камеру 12, что позволяетее термостатировать. Открытый торецкожуха 11 позволяет подвести приемный элемент датчика 1 непосредственнок камере 12,Устройство работает следующим обрчзом,В кожух 11 с помощью системы 7тевмостатирования подают охлаждающуюжидкость. Далее по мере поступления,охлаждающая жидкость переливаетсячерез край кожуха 11, попадает в сбор.ник 13 и выводится в систему,Включают генератор 4, возбуждающий ультразвуковые колебания излучателя 1 О, С помощью средств 5 и 6подачи и приема - последовательнопропускают в потоке жидкости черезкамеру 12 суспензию иммуносорбентов,исследуемую пробу и буферный раствор, а затем в камеру 12 подают раст- ввор меченных иммуноглобулинов и оста "навливают поток.С помощью узла 14 движения раствора возвратно-поступательно перемешают по камере 12 раствор меченныхиммуноглобулинов на 0,5 длины ультразвуковой волны, циклически подаваяи выводя часть раствора из камеры 12.Через 1-3 мин узел 14 выключают ис помощью средств подачи пропускают через камеру 12 буферный раствор.Останавливают поток жидкости и с помощью датчика 1 и регистратора 2 регистрируют информативный сигнал отиммуносорбентов, находящихся в камере 2 в ультразвуковом поле, Есликонцентрация иммуосорбентов мала,то снимают ультразвуковое поле и регистрируют информативный сигнал отиммуносорбентов, осевших на нижнююповерхность полости камеры 12,