Способ определения активности сериновой протеазы

СОЮЗ СОНЕТСНИХСоцИАЛИСТИЧЕСНИхРЕСПУВЛИН ств в каче испольН где В,Ан 24.08,8 19) Зало Карл сон лож- ами 89,йцин, в ЕЛЕНИЯ АКТИВ АЗЪ путем вз ржащего матер еществом, соаминокислот я тем, что,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРпо делАм изОБРетений и ОтнРытий(72) Лайф Роджер ЗимонАри Элли, Лайф Эрик АуГеран Клэсон (БЕ)(54)(57) СПОСОБ ОПР НОСТИ СЕРИНОВОИ ПРО имодействий энзимсо ала с маркированным держащим производнь .отличающий ЯО 1233806 А 3 111 4 С 12 Ц 1/38//О 01 И ЗЗ/5 тве маркированного вещеуют вещество общей формулы-(А , -(А )-(А- в одород, ацил;валин, иэолейцин, аланииглицин- пролин, фенилаланин, глицин, валин, пипеколиновое производное глютаминовой кислоты, пироглютаминовая кислота, лейцин, алании, глютаминовая кислота, с ный метиловый эфир глют новой кислоты, аргинин, изолейцин, тирозин;- фенилаланин, пролин, лесерин, глицин, валин, ала -А, - аргинин, лизин;Р - люминол, изолюминол; и- Оили 1.:Яркера " Г(юминола или изолПминаля,редетякт пу -ем добавле-:ия акисли.еля и измерения количества испусказмогс при Зтсм сьетя при помощи ЛОд:.одящего приспособления, При этомколичества нысвабаждяюшега маркералинейно пропорциональна количеству знзимя, Озтому количества светя. редставляет собой меру для активнос -И ПРОТЕЯЗЫ.р и : е Г 1: к рас:=Ор, содер.:0 мкл среды в котором спектрофлуорэметрически определяют количествов-.:свабадивпегася маркера ,иэалюминопя 3.);отоуае саответству т 0,0 единицы уракинязы,.Н и и м е р 2, К раствору согласна"1 л симерТ 1, сад "ржЯщему Б КЯЧесТВефермента тромбин, добавляют в качесТве субствата вещества со стр ктурай,приведенной в габл. 1. ОпределяютМИНИМЯЛЬНСЕ КСЛИЧЕСТНО фСРМЕНТЯ,чКз), которое ВОзмокна Выявить припомощи используемых субстрятов.Рсзультаты сведены н табл, 1. Т Я б л и и яЕЕ( мол. Энзим ПриСубс-рят мер Трипсин Н-В-ЧЯ 1-Е,еп-АГозНС 5,2510рС 1 пу-Агд - Х ВЕ-.Сс0 а ВасЕе-СЕц(ИС,. Н ) -",Х- ,Гд-Я 1-НС 1СЬО-Ре-Рго-АТРя Г:С . 6.,25 10 2,.5 10 Вас-Ре-РГО-АГЕ.-ТВ Е НС 1 5,0 О Н РНе Рга Аг 1 э 1 2 ЕГ / 2,5 10 " 2 с О Вк-Агц-Е,пш НСЕ. 5,0 О Изобретение относится к биохимии, в частности к способу определения активности сериновай пратеязы.Целью изобретения является повышение чувствительности способа,Способ осуществляют следующим ааразом,В энэимсодержаший материал добавляют субстрат - маркиронанное вещсст Но, содержащее производнье аминокис-.лот, общей формулыН, -(А,)-(А,)-ЕА,)-А -Ргде Б, - водород, ацил;А - валин, из ол ейцин, алан ин,глицин;А - гролин, фенилаланин, глицил,валин, пипеколинаное произ водное глютяминовой кислоты,пироглютаминавая кислоталейцин, алании, глютамина вая кислота, сложный метиловый эфир глютаминавай кислоты, аргинин, изолейцин,тирозин;А - фенилаланин, пралин, лейцин,.серин, глицин, валин., алании;А, - аргинин, лизин;Н - люминал, изолюминол;п - 0 или 1.Реакцию взаимодействия протеяэы и субстрата проводят В условиях, обеспечивающих оптимальность прзте - кания реакции для данного энзимя. В зависимости от степени активности протеазы и концентрации субстратареакцию проводят в течение 0,5-5 мин прекраЯют добавлением кислоты или Ояем количества в св ооадивцесс яВг-Аг 8-1 я 1 НС 1 СЬо-РЬе-Аг 8-1 я 1 НС 1 Вос-С 1 у-Рго,уя 1 я 1 НС 1 Вос-Ча 1-1,еп,уяя 1 НС 1 10 2 П р и м е ч а н и е : Вос - третичный бутилоксикарбонил,СЪо - карбобензокси, Вк - бензоил,РС Гц - пироглютаминовая кислота,5с применением сериновых ферментови субстратов, согласно табл. 2. Т а б л и ц а 2 ПриФерментмер СубстратУрокиназа рСЬц-СЬУ-Агдя 1 0,01 единицы рСЬ-СЬУ-Аг 8-рХа 0,5 единицы О 01,10единицы 3,5 10единицыН-П-РЬе-р 1.р-Аг 8-р 1 а 0,02 Оединицы казеина 1 10единицыказеина Н-Ча 1 - Еец-Еуя -рЫа Н-Э - Ча 1 - Ееп-Аг 8-1 я 1-2 НС 1;СЬо-С 1 у-Рго-Аг 8-1 я 1 НС 1;Восе-СХц(С,. Н ) -СТУ-Аг 8-1 яТ НС 1;Н-РЬе-Рго-Агдя 1;Вл-Аг 8-1,ци НС 1;Вг-Аг 8-1 я 1 НС 1;Н-Еец-Бег-Аг 8 - 1 я 1 2 НС 1;СЬо-С 1 у-С 1 У-Аге.цщ АсОН;Ас -А 1 а-Р го -Агая 1;Бцс-А 1 а-Рго-Ьуяя 1;Н-О-Аг 8-Ча 1-Тугя 1-2 НС 1,Количество высвободившегося маркера соответствует используемой вопыте концентрации фермента,ВНИИПИ Заказ 2789/60 Тираж 490 Подписное Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул . Проектная, 4 П р и м е р 3, Повторяют осуществление способа, согласно примеру 1,3 Тромбин Тоя-РЬе-Рго-Аг 8-1 я 1 5 Плазмин Вос-Ча 1-1,ец-Еуяя 1 Представленные данные показывают, что использование изобретения приме меры 1, 3, и 5) позволяет повысить чувствительность способа определе - ния активности сериновых протеаз в сравнении с известным способом (примеры 2, 4 и 6), 45 П р и м е р 4. Повторяют осуществления способа, согласно примеру 1, в качестве фермента используют