Способ одновременного определения комплекса ферментов обмена нуклеиновых кислот

,Ю авй ГОСУДАРСТВЕННОЙ КОМИ 1 ЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬТИ ИЗОБРСВИДЕТЕЛЬСТВ ОПИСАНИЕ(71) Специальное конструкторско-тенологическое бюро биологически активных веществ Главмикробиопрома С(56) 1. Иезй 1 е М., КоЬегйз И., 6.Во 1, СЬев. 1969, 244, р 5219.2. Ч.АЛс)гавв, Г.А.Рц 11 и, О.Во 1. СЬев., 1978, Ч. 253, р. 21613. Карап Й,О. МейЬодв Епгуво 1,1 955, Ч. 2, р. 473,4. В 1 ва С., Ра 1 ейа 1"герайопо 1 Завез, КЬопцс 1 еоздев апд Оеохуг 1 Ьопцсеовдев Ьу Апоп-Ехс 1 цзопапд Рагййоп СЬговайодгар)у опСайоп. Ехсйацде Кез 1 п. Арр 1 сайопГо СЬе Аззау оУ РЬопцс 1 еойсе йедцсйазе, Оеаппавеапд 14 цс 1 еоздаЫ.Апа 1. ВосЬев, 1975, Ч. 67, рб 25(541 (57) 1, СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОГООПРЕДЕЛЕНИЯ КОМПЛЕКСА ФЕРМЕНТОВ ОБМЕНА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, включающийферментативную обработку субстратануклеозид-фосфата исследуемой пробой ихроматографическое разделениепродуктов реакций с последующей ихидентификацией и качественной оценкой определяемых ферментов, о т л ич а ю щ и й с я тем, что с цельюупрощения процесса и расширения диапазона определяемых ферменъов, разделение продуктов реакций осуществля"ют тонкослойной хроматографией в системе растворителей диоксан; изопропиловый спирт: 5 М аммиак: 1 И ацета аммония, взятых в соотношении 30:18: 49:3, .2. Способ по и. 1, а т л и ч а " ю щ и й с я тем, что в кстрата используют нуклеозди- или трифосфаты.3. Способ по пп. 1 и 2, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве исследуемой пробы используют экстрак или ферментный препарат из ЕзсЬег 1- сЬа со 1.Изобретение относится к аналитической химии и может быть использова но для комплексного качественного определения ферментов обмена нуклеиновых кислот.Известны способы определения Ферментов обмена нуклеиновых кислот в отдельности,Так, известен способ определения 5 -нуклеотидазы, который основан на измерении паранитрофенола, образующегося из паранитрофенилфосфата под действием 5-.-нуклеотидазы 1 11. 10 Известен способ определения нукле 1 2 В озидазы, который основан на измерении рибозы, образующейся из нуклеозида под действием нуклеозидазы ( 2 ,Известен способ тестирования дезаминазы, который основан на определении. изменения оптической плотности реакционной смеси при 265 нм3 1 Основным недостатком указанных способов является ограниченность их применения, поскольку данные способы применимы для определения только одного вида фермента. Кроме этого, зти способы не унифицированы и недостаточно специфичны,Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к изобретению является способ одновременного определения комплекса 25 Ферментов обмена нуклеиновых кислот,в частности трех ферментов: рибонуклеотидредуктазы, дезаминазы и нук- З леозидазы, который заключается в обработке исследуемой пробой, содержащей определяемые ферменты, субстрата,в качестве которого используют меченый тритием цитидин ди- или трифосфат, гидролизе образовавшихся нуклеотидов в нуклеозиды при добавлениикартофельной апиразы и щелочной Фосфатазы и хроматографическом разделении продуктов реакций на катионообменной смоле аминекс Апри 50 С 40 и под давлением с последубщей их идентификацией и качественной оценкой определяемых Ферментов. Продукты действия указанных Ферментов - основа 50 ния и нуклеозиды разделяются за 50 мин. Наличие и наименование ферментов определяют по месту выхода элюированных продуктов на хроматограммеНедостатками известного способа55 являются пригодность известного способа для определения только трех ферментов, т.е. недостаточно широкий диапазон определяемых ферментов, а также сложность процесса, заключающаяся в: использовании хроматографиипод давлением; применении сложногои дорогостоящего оборудования ( хроматографа под давлением, сцинтилляционного счетчика, применении труднодоступной смолы аминекс А, использовании для определения целевыхферментов - дополнительных Ферментовапиразы и щелочной Фосфатазы и т,д.При отработке технологическихпроцессов выделения различных ферментов (например, полинуклеотидфосфорилазы из Е,со 11) необходимо быстро иточно определять наличие примесных(сопутствующих) Ферментов в грубомэкстракте биомассы и по стадиям очистки, чтобы вводить стадии, селективно удаляющие примеснце Ферменты. Привыделении ферментов по отработаннойтехнологии необходимо следить за качеством ферментных препаратов на стадиях выделения и эффективностью очистки целевого Фермента от примесных.Одновременное определение нескольких ферментов, содержащихся в препарате, известными способами невозможно,а каждого в отдельности - занимаетмного времени, к тому же при совместном присутствии нескольких Ферментовэти способы становятся недостаточно.специфичными и не позволяют получатьправильные результаты, Все это ставитзадачу разработки достаточно простого и более универсального способа,позволяющего определять большее количество Ферментов,Целью изобретения является упрощение способа и расширение диапазонаопределяемых ферментов,Поставленная цель достигается тем,что согласно способу одновременногоопределения комплекса ферментов обмена нуклеиновых кислот, включающемуферментативную обработку субстратануклеозид-фосфата исследуемой пробой и хроматографическое разделениепродуктов реакций с последующей ихидентификацией и качественной оценкой определяемых ферментов, разделение продуктов реакций осуществляют.тонкослойной хроматографией в системе растворителей диоксан: изопропиловый спирт: 5 М аммиак: 1 М ацетатаммонйя, взятых в соотношении 30:18:И:3.При этом в качестве субстрата обычно используют нуклеозид-моно- диили трифосфаты.Сущность способа заключается вследующем.Под действием указанных в заявкеферментов субстрат (например, АДФ)претерпевает ряд последовательныхопревращений по схеме:0 аза за-. очка в всегда длинне ысокоо в обыч Фермен твляет После инкубации реакционную смесь наносят на пластину Силуфол Уфи проводят хроматографию в системе растворителей диоксан - изопропиловый спирт - 5 М аммиак - 1 М ацетат аммония при соотношении последних 30:18:49;3. После хроматографии пластины просматривают в Уф-свете, фиксируЮт контуры пятен, измеряют Вт каждого пятна,. идентифицируют продк" ты реакции, и по ним качественно определяют наличие тех или иных ферментов. 3101В качестве исследуемой пробы обычно используют экстракт или ферментный препарат из ЕзсЬег 1 с 61 а со 11,Благодаря возможностям системы, выбранной для хроматографического разделения компонентов нуклеиновых кислот, которая позволяет разделять до 10 компонентовнабор определяемых Ферментов более широк, чем в изУказанная цеп заимопревращений практически является полной, а иногда и е указанной,так как даже в в чищенных препаратах ферменто но содержитсянабор примесных тов.Способ осущес ся следующим образом.В реакционную смесь, содержащуюсубстрат, добавляют ферментный препарат и инкубируют смесь 20 мин при 37 С, За время йнкубацци исходный субстрат, например аденозин-дифосфорная кислота 1,АДФ ), претерпевает ряд последовательных превращений под действием соответствующих ферментов таким образом, что продукт реакции одного из ферментов является субстратом для другого и т.д. 3 й 5 ф вестном способе. При этом сам способ является более простым,П р и м е р. При выделении полинуклеотидфосфорилазы из биомассыЕ.со 11 определяют наличие полинуклеотидфосфорилазы и примесных ферментов в грубом экстракте, на стадияхвыделения фермента и в готовом продук"те. Процедура анализа совершенно одинакова для всех стадий технологического процесса и заключается. в следую"щем: к 0,2 мл реакционной смеси, содержащей 0,025 М АДФ в 0,3 М буферном растворе трис-НС 1 рН 8,0+0,001 Ммагний ацетат+0,001 И ЭДТА, прибавляют 0,020 мл фермента (0,05 мг бел"ка) с каждой стадии очистки, Реакционную смесь инкубируют 20 мин при37 вС, реакцию останавливают прогреванием реакционной смеси в течениемин в кипящей водяной бане. Контрольную пробу готовят аналогичным 45 образом, но фермент прибавляют в мо"мент прогревания реакционной смеси.На пластины Силуфол Уф5 М 15 смшприцом наносят по 10 мкл опытнойи контрольной реакционной смеси полофв сой, ширина которой не превышает2-3 мм. Хроматографию проводят всистеме растворителей диоксан - изо"пропиловый спирт - 5 М аммиак - 1 Мацетат аммония (30:18:49:3). После ы хроматографии пластины просматривают в Уф-свете, контуры пятен обводяткарандашом, измеряют М каждого пятна, идентифицируют образовавшиеся11 5 1013475 продукты реакции и по ним качественно определяют наличие тех или иных ферментов. 1На стадии грубого экстракта биомассы Е.со 1 обнаружены следующие з Ферменты: ПНф-аэа, 5 -нуклеотидаза, Аденозиннуклеозиддифосфатаза и зкзорибонуклеаза.На стадии 55-ного насыщения суль- Аденин фатом аммония обнаружены: ПНф-аза, 10. нУклеозиддифосфатаза и зкзоРибонУкле Гипоксантин аэа, деэамининаза, 5 "нуклеотидаза, нуклеозидаза.На стадии готового продукта обна" ружены; ПНф-аза, нуклеозиддифосфат 1 аза и экзорибонуклеаза.В таблице представлены результаты обнаружения ферментов. бПродолжение таблицы 0,80 5"Нуклеотидаза0,95 Нуклеозидаза 0,86 Адениндазамин- аза Использование предлагаемого способа по сравнению с известными позволит: расширить диапазон определяемыхферментов. Предлагаемый способ позволяет одновременно определять шесть ферментов обмена нуклеиновых кислот, упростить способ за счет сокраще-ния стадий способа с 10 до 6, иеключения сложного и дорогостоящего обо" рудования (хроматографа), исключения труднодоступной смолы Аминекс"6 и дополнительных Ферментов (картофельной апиразы и щелочной Фосфатазы), исключения ионообменной хроматографии под давлением и при температуре. Величины 20Ферментыю2 3 Продукт реакций ПолинуклеотидФосфорилаза фз Поли А Экэорибонуклеаза+нуклеозид".дифосфатаза 0 38 АМФ Составитель О.Скородумова .Редактор О.Полозка Техред О.Неце Корректор М.Демчик Филиал ППП фПатентф, г, Ужгород, ул . Проектная,Заказ 2942/34 Тираж 521 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий1 Ч 3035, Москва, Я, Раушская наб., д. 4/5