Меченный тритием хлорид тетрафенилфосфония в качестве индикатора на мембранный потенциал

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 801217861 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Вадуунмвм см лтсмю ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Пермский ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. А.М.Горького и ЛГУим. А.А.Жданова(54) МЕЧЕННЫЙ ТРИТИЕМ ХЛОРИД ТЕТРАФИНИЛФОСФОНИЯ В КАЧЕСТВЕ ИНДИКАТОРА НА МЕМБРАННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ,(57) Меченный тритием хлорид тетрафенилфосония ФормулыСаТЬР (С 6 Нь) Св качестве индикатора на мембранный потенциал.Таблица 1 Значения Е, в системах Соединение БензолХлороформэтилацетат 85 -ная муравьино" вая кислота (5:4:1) н-Бутиловый спирт- уксусная кислота- вода ( 4:1:5) этилацетат 85 -наямуравьино-.вая кислота (4:4:1)(С Н,)Р) С 1 0,18+0,02 0,17+0,02 0,19+0,01 Изобретение относится к химии фосфорорганических соеднений с С-Р связью, а именно к новому соединению - меченному тритием хлориду тетрафенилфосфония формулыС ТпР(ГьНп)з С 1который может быть использован для определения мембранного потенциала митохондрий.Цель изобретения - йовьппение точности определения мембранного потенциала митохондрий и снижение токсичности индикатора на мембранный потенциал.На чертеже представлена реакционная система для синтеза меченного тритием хлорида тетрафенилфосфония.П р и м е р. Получение меченного тритием хлорида тетрафенилфосфония.В ампулу 1 через перетяжку 2 загружают5 г зерен кварца размером 100-200 /" с предварительно нанесенным на его поверхность насьпценного спиртового раствора 20-30 мг МаС 1, а затем 20 мг трифенилфосфина иэ бензольного раствора. В ампулу вводят 50 мкл гексатритийбензола с удельной активностью 2 Ки/мл. Перетяжку 2 перепаивают и реакционную систему выдерживают при 5 С (твердая фаза) в течение 10-15 сут для накопления продукта реакции. Затем с помощью магнитного бойка 3 разрушают перегородку 4 и непрореагировавший бенэолперегоняют в новую реакционную ампулу 5, Из ампулы 1 целевой продукт вымывают 5 мл воды. Выход 85+52. Ана 5 лиэ полученного продукта проводилсяпо методам тонкослойной хроматографии и многократной перекристаллизации.Из ампулы 1 непрореагировавший 10 гексатритийбензол (взятый в 5 кратном мольном избытке) перегоняют вновую реакционную ампулу 5, в кото-.рой находятся зерна кварца л 5 г(размером 100-200)д) с предваритель но нанесенным на их поверхность20-30 мг МаС 1, а затем 20 мг ( Н ) Р.Ампулу запаивают и выдерживают при0 С (снег) в течение 10-15 сут длянакопления продуктов реакции, после.20 чего ампулу вскрывают. Отогнанныйтритированный бензол пригоден длянового синтеза меченного тритиемхлорида тетрафенилфосфония. Полученный целевой продукт вымывают через 25 зерна кварца3-5 мл Н 0 (бидистиллят),. Выход 86+3%.Хроматографический анализ полученного соединения показал его полнуюидентичность немеченному хлориду тет" 30 рафенилфосфония.Результаты тонкослойной хроматографии полученного соединения инерадиоактивного хлорида тетрафенилфосфония представлены в табл.1.121861 Индикаторные свойства нового соединения, егоструктурного аналога и эталона приопределении мембранного потенциала митохондрий Т а б л и ц а 2 Токсичность Точность определения ( предельные концентрации)а Соединение 10 5 10 б М Токсическиеэффекты Валиномицин(комплекс сКили КЪ) 65(6 ИЬИН Токсическиеэффекты С,Т,Р(С, Н,), 01 Дополнительные доказательства ониевой структуры соединения фосфора получены на основании постоянства массовой активности при многократной перекристаллизации полученного продукта в присутствии нерадиоактивного хлорида тетрафенилфосфония.Для определения мембранного потенциаламитохондрий при помощи проникающего липофильного катиона тетрафенилфосфония, взятого в вйде хлористой соли, использовали митохондрии печени белой крысы, выделенные по известной методике. Суспензия митохондрий представляла собой изотонический раствор сахарозы 0,25 моль/л и Трис-С 1 буфер, рН ,4, Исходная суспензия содержала митохондрии в ,концентрации около 50 мл белка/мл. Для проведения опыта аликвота суспензии разбавлялась аналогичной средой в 100-200 раз. Затем производилась преинкубация рабочей суспензиисо всеми ингредиентами, кроме радио. активного катиона. Хранение митохонд-, рий и все опыты проводились при 0 С. Преинкубация была необходима для достижения стационарного распределения всех катионов между митохондриями и средой. Затем вносился радио" активный катион тетрафенилфосфония ( ТФФ )и изучалась кинеФика его наИз данных таблицы видно, что применение нового соединения увеличива-ет точность определения мембранного потенциала по сравнению с эталоном копления в митохондриях. Для отделения митохондрий от среды применялось фильтрование через миллипоровые фильтры с диаметром пор 0,45 мкм. Митохондрии промывались на фильтре нерадиоактивной средой. Затем про" изводилось определение радиоактивности митохондрий и среды и вычисля- лись коэффициенты накопления ТФФ Мембранный потенциал рассчитывался по формуле Нернста с использованием данных о равновесном распределении ТФФ,Одним из критериев хорошей сохранности митохондрий является их способность длительное время поддерживать достигнутый уровень стационарного распределения проникающего катиона. В В опытах с ТФФф уровень накопления поддерживался в течение 1 ч и более. Никаких токсических эффектов ТФФ+ не обнаружено. Проведенное морфологическое изучение митохондрий при помощи электронного микроскопа показало, что в структуре митохондрий не обнаружено никаких изменений, которые можно было бы приписать действию нового препарата.Сравнение индикаторных свойств но" вого соединения, его структурного аналога и эталона приведено в таблице 2. 10- 10 М Не токсично валиномицином на несколько порядков,.а также не дает токсических эффектов,присущих эталону и структурному аналогу нового соединения.