Способ определения фибронектина

,1т. ОПИСЯНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ АВТОРСКОМУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(72) Г.А.Ермолин, В.Э.Котелянский; Е.Е,ЕФремов, М.А.Глухова, Л,В,Курма-. нова, И.А.Черноусов и М,Л,Метсис (71) Всесоюзный кардиологический ,научный центр АИН СССР(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИБРОНЕКТИНА путем инкубации исследуемойпробы с иммуносорбентом, содержащимв качестве лиганда желатин, с поспедующим определением связавшегося ссорбентом фибронектина, о т л и -ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения точности способа приопределении биологически активногофибронектина, в качестве иммуносорбента используют полистирол, обрабо-.танный раствором желатина при рН 8,010,0, взятого в концентрации 10".12 мкг/мл.38742 2 1 11Изобретение относится к иммунохимии и может быть использовано в клинике для определения дефицита фибронектина в биологических жидкостях организма, выявления гиперФибронектинемии, а также для количественного определения фибронектина в процессе его промьппленного производства.Известен способ определения фибронектина с помощью "ракетного" иммунофореза, предусматривающий нанесение контрольного и исследуемого образца в лунки пластин иэ геля агарозы, содержащей антитела к Фибронектину, и осуществление электроФореза в течение 2-1 Ь ч при 4 С. После этого гели отмывают 3-4 дня, высушивают, окрашивают, измеряют вы-, соту образовавшихся "ракет" и по высоте определяют содержание фибронектина 11,1.Недостатками указанного способа являются длительность определения и низкая производительность (не более 20-25 анализов в день). Кроме того, этим способом определяют только суммарный фибронектин без учета его биологической активности, характеризующей состояние Факторов неспецифической защиты организма. 5 10 15 20 25 35 ЗО сущности и достигаемому результатуявляется способ определения Фибронектина путем инкубации исследуемойпробы с иммуносорбентом, содержащимв качестве лиганда желатин, представляющим собой бактериальныеклетки, обработанные глутаровымальдегидом и 0,1-0,5 Е-ным растворомжелатина, с последующим определением связавшегося с сорбентом фибронектина по агглютинации, осуществляемым визуально или путем микроскопирования 121,Чувствительность определения0,125 мкг фибронектина, при этомопределяется фибронектин, сохранивший биологическую активность, т.е.способность связываться с желатином.Недостатком способа являетсяневысокая точность определения, обусловленная тем, что при постановке,агглютинационной пробы готовят рядразведений исследуемой сыворотки ф 5(1:1-1:356) и оценку результатовосуществляют путем визуального наблюдения или с помощью микроскопиНаиболее близким по технической рования, что не исключает субъективной оценки.Точность и воспроизводимостьопределения Фибронектина зависиттакже от свойств и спецификацииприменяемого иммуносорбента, полученного на основе бактериальныхклеток.Целью изобретения является повышениеточности способа приопределении биологически активного фибронектина,Указанная цель достигается тем,что согласно способу определенияфибронектина путем инкубации исследуемой пробы с иммуносорбентом,содержащим в качестве лиганда желатин,с последующим определением связавшегося с сорбентом фибронектина,причем в качестве иммуносорбентаиспользуют полистирол, обработанныйраствором при 8,0-10,0, взятого вконцентрации 10-12 мкг/мл.Это позволяет не только количественно определить Фибронектин,обладающий биологической активностью,но и значительно повысить точностьопределения за счет использованиясорбента, обладающего заранее заданными, стандартными свойствами,что создает реальные предпосылкидля автоматизации определенияОпределение связавшегося с сорбентом Фибронектина можно осуществлять иммуноферментным методом. Способ обычно осуществляют следующим образом. Полистирол при рН 8,0-10,0 обрабатывают раствором желатина при концентрации 10-12 мкг/мл в течение 15-24 ч при 4 С. Полученный иммуносорбент многократно отмывают водой с 0,05% Твин 20, затем наносят образцы плазмы крови и инкубируют их 30 мин при 37 С. После отмывки несвязавшихся белков на образовавшийся комплекс полистирол-желатин-фибронектин наносят антитела к фиб" ронектину, ковалентно связанные с ферментом, инкубируют 30 мин при 37 С,отмывают, добавляют соответствующую субстратную смесь и по интенсивности окраски определяют содержание фибронектина в исследуемой пробе. Предлагаемым способом можно определить биологически активный фибронектин в количестве от 5 до 800 нг/мл, Времяпроведения анализа не превышает1138742 Составитель А,ДижурРедактор С.Патрушева Техред Л.Коцюбняк КорректорЕ.Сирохман Заказ 10681/35 Тираж 897 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва,. Ж, Раушская наб., д.4/5Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул,Проектная, 4 1,5-2 ч, если учесть, что полистироловые плашки или пробирки можно заранее обрабатывать желатином и хранить до использования.П р и м е р . В лунки нового титровального планшетацля серологических реакций заливают по 200 мкл раствора желатина в карбонатном буфере рН 9,6 (содержание белка 10 мкг/мл). Планшет инкубируют в течение 24 ч при О 4 С, затем многократно отмывают водопроводной водой с 0,05 Твин 20 и вносят в лунки по 200 мкл исследуемых образцов плазмы крови, разведенных 1:1000 фосфатно-солевым буфером 15 рН 7,2. Образец инкубируют в лунках в течение 30 мин при 37 С, Лунки снова отмывают и в каждую добавляют по 200 мкл конъюгата противофибронектиновых антител с пероксидазой, 20 разведенного 1:2500, Конъюгат инкубируют 30 мин при 37 С, затем отмыва". ют лунки и каждую лунку заполняют 200 мкл субстратной смеси, состоящей из 0,0015 -ного раствора НО с 0,01 ортофенилендиамина в 0,05 М цитратном буфере, рН 4,7, После инкуо бации в течение 1 О мин при 37 С реакцию останавливают добавлением в лунки 50 мкл 50 -ной серной кислоты. Интенсивность развившейся окраски субстратной смеси измеряют фотометрически при Й = 492 нм. Предлагаемый способ прост и доступен для освоения. Используя заранее заготовленные микротитровальные планшеты, обработанные желатином, можно провести определение за 1,5- 2 ч, что позволяет отнести предлагаемый способ к методам экспрессанализа.Следует отметить также воэможность унификации предлагаемого способа, его высокую чувствительность и точность.