Способ дифференцирования давности образования пятен крови

СОЮЗ ССВЕТСНИХбдюдипвиедддРЕСПУБЛИК 4(5) С О И 33/48 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯн датддднддд сдидпзъдтви гССУДАРСТщНнцй НОМИТЕТ ССФПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И СТИРУИЙ(7.). Актюбинский государственныймедицинский институт(54) (57) . СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИРОВАНИЯДАВНОСТИ ОБРАЗОВАНИЯ ПЯНЕН КРОВИпутем экстрагирования пробы буфернымраствором, спектрофотометрированияэкстракта в видимом диапазоне длин ЯО.1138741 А волн с добавлением в исследуемуюпробу гексациано-(Ш феррата калия,о т л и ч а ю щ и й с я тем,что,с целью повыщения точности способа,снектрофотометрирование проводятв области 575-595 нм, дополнительноснимают спектр поглощения без добавления гексациано-(Ш) феррата калия,рассчитывают разность максимальныхзначений оптических плотностей растворов до и после добавления гексациано-(Ш ) феррата калия, далее определяют значения оптической плотностив иэобестической точке в облаети 585595 нм и по отношению полученнойразности к оптической плотности визобестической точке дифференцируютдавность образования пятен крови.1 1138Изобретение относится к судебноймедицине и может:быть использованов гематологии.Известен способ, в котором приустановлении давности образованияпятен крови также определяют состояние дериватов гемоглобина путем изучения его спектральных характеристик в, видимой области длин волн 1.13.Недостатком этого способа являет".ся низкая чувствительность в определении состояния дериватов гемоглобина пятен крови, что не позволяетего испольэовать в судебной медици-.не для установления времени воздействия абиотических факторов окружающей среды на кровяные пятна.Целью изобретения является повышение точности способа,Указанная цель достигается тем,что согласно способу дифференцирования давности образования пятен крови путем экстрагирования пробы буферным раствором, спектрофотометрирования экстракта в видимом диапазоне длин волн с добавлением в исследуемую пробу гексациано-( Ш ) Ферратакалия, снектрофотометрирование проводят вобласти 575-595 нм,дополнительно снимают спектр поглощения бездобавления гексациано-( Ш ) феррата30калия, расситывают разность максимальных значений оптических плотностейрастворов до и после добавления гексациано- (Ш ) Феррата калия, далее определяют значения оптической плотности З 5в изобестической точке в области585-595 нм и по отношению полученнойразности к оптической плотности визобестической точке дифференцируютдавность образования пятен крови.Способ осуществляют следующимобразом.Кровь экстрагируют из кровяныхпятен в Фосфатном буфере ЗеренсенаРН 7,8, готовят небольшое количествораствора гексациано-(Ш 1 феррата ка"лия в фосфатном буфере Зеренсена;осуществляют центрифугирование полученных вытяжек,из пятен крови; обестпечивают одинаковую концентрациюдериватов Нв во всех растворах, осуществляя контроль по значению оптической плотности этих растворов придлине волны, равной 400 нм; проводятспектрофотометрирование всех исследуемых растворов с записью спектровпоглощения в области 575-595 нм.Далее в исследуемые растворы добав 741 2ляют 0,57.-ный раствор гексацианоШ Феррат калия, обеспечивая полный перевод оксигемоглобина исследуемых растворов в метгемоглобин. Вновь проводят запись спектров поглощения полученных растворов в области 575- 595 нм, Затем осуществляют определение значений оптической плотности. прн длине волны 575-580 нм для вытяжек из кровяных пятен до и после гексацнано-( Ш ) феррата калия и нахо дят их разность. Затем определяют значение оптической плотности растворов в изобестичеокой точке при длине волны 585-595 нм и рассчитывают отношение разности максимумов оптических плотностей при 575-580 нм ( до и после добавления гексацианоШ) феррата калия) к значению оптической плотности в изобестической точке при 585-595:.нм. Полученное при этом значение 5=6 07 /Оэ является основным критерием, динамика которого свидетельствует о состоянни,дериватов гемоглобина крови (переход оксигемоглобина в метгемоглобин), обусловленных процессом старения крови )п ч 11 го, в частности кровяных пятен,П р и м е р. Для исследования представлены два пятна крови на одинаковом предметоносителе, хранивших;- ся неизвестное время в одинаковых условиях воздействия окружающей среды. Необходимо подтвердить или же опровергнуть возможность одновременного образования этих кровяных пятен. Для этого нарезают по несколько (например по 5 шт,) кусочков ( раз-. мером до 0,5 х 0,5 см) образцов (проб) от обоих кровяных пятен и осуществляют вытяжку ( в течение 30-40 мин) из всех образцов обоих кровяных пятен в Фосфатном буфере Зерен- сена рН 7,8 приготовленного из 1/15 И растворов солей ЙаНРО 2 НО и КН РО, смешиваемых в определенных пропорциях согласно существующей методике. Готовят небольшое (2-3 мл), количество 0,53-ного раствора гексациано-(Ш) феррата калия путем растворения К Ге(СЙ) 1 в фосфатном буФере Зерен- сена, Осуществляют центрифугированне полученных вытяжек из пятен крови в.течение 10 мин при 5000 об/мин. Используя фосфатный буфер Зеренсена, обеспечивают одинаковую концентрацию дериватов Нв, во всех растворах, осуществляя при этом контроль по значению оптической плотности этих раство.Тигор Редактор С.Патруше Заказ 1 Об 81/35 Тираж 897НИИПИ Государственного комитето делам изобретений и открытии3035,Москва,Ж,Раушская наб одписное 4/5"Патент", г,ужгород,ул.Проектная,4 ч ал ППП 3 1138 ров, которая может быть равной 1,75 при сс 400 нм. Далее проводят спектрофотометрирование всех десяти йроб, При этом согласно существукицей методике осуществляют запись (например, на СФ - 10 ) спектра поглощения в области 575-595 нм первого раствора дериватов Нв, используя при этом плоскопараллельные кюветы с толщиной рабочего слоя раствора, равной 10 мм. 10 В пробирку наливают 5 .мл исследуемого раствора и добавляют 0,1 мл 0,57- ного раоувор К Ге(СЙ)6-1, что обеспечивает полный перевод (помешивать 20-30 с)1 оксигемоглобина исследуе"5 мой пробы в метгемоглобин. Выливают полученный раствор в кювету толщиной 10 мм и производят ( согласно методике спектрофотометрического исследованиязапись спектра поглощения полученного раствора на том же, что и в первом случае, бланке. Извлекаютиз спектрофотометра бланк с двумя спектрами поглощения. Проводят последовательно спектрофотометрирование ( аналогично описанному) всех оставшихся девяти проб. Далее проводят обработку полученных графических данньсх.Допустим, что при длине волн,30 Равной 578 нм,оптическая плотность первой пробы раствора дериватов Нв первого пятна крови оказалась равной 0,800 (Рс = 0,800 ), а после добавления в этот раствор гексациано-(Ш ) феррата калия получили р: 0,625. Следовательно, разность максимальных. значений оптических плотностей приД =578 1 нм будет равной 0,175 (60= =О, - 0),т,е. ЭО =0,175. Пусть значенйе оптической плотности дерива 40 741 4тов Нв в иэобестическойточке=592 нм)1 оказалось равным 0,550, т.е,О =0,550.Тогда значение 5=О-с/и 2для первой пробы первого пятна 51будет равно 0,318, т.е, =0,175/0,550=0,318. Если для,последующих,проб первого пятна будут полученызначение 5 =0,320, Ьр 0,310, 5=, 0,315и 5 0,307, то получают значениес,5= 0,31410,005. Далее, исследуя иобрабатывая статистические данные,полученные по материалам второгокровяного пятна, допустим, получено .5"=0,242 +0,012. После этого вычисля-.ют критерий значимости й Стьдентапо формуле В приведенном примере получают0 314 - 0 242 0,072 0,013Значение 1=5,54 (при п=5) свидетельствует о том, что процесс превращения дериватов гемоглобина крови в. пятнах достоверно ( р С 0,001) различим. Следовательно, учитывая идентич" ность условий хранения и физико-механических свойств предметоносителей, это достоверное различие должно быть . связано с различием во. времени хранения,т.е. исследованные пятна крови .образованы в различное время.Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить точность определения состояния дериватов гемогло бина крови и дает возможность более достоверно исследовать процесс старения крови, например при решении практических задач судебной медицины.