Способ определения фибронектина в плазме крови

(51)4 С 01 И 33/5 ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТРИ ГКНТ СССР НИЯ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Центральный научтельский институт эпиМосковский медицинскиИ.М.Сеченова и Всесоюследовательский инсти-исследоваемиологии, 1-й институт им.ный научно-исут биотехнолоЕ.В.Сокуренко,И.Б.Богин, В.И,Огар Басов ская Сури 73 (О Ва 1 ц е 1 аз 985В ОПРОВИетени едици носитс Изобретение отни может быть исп ицин тс ользовано для кол ения фибронекчественного определ тина в плазме крови.Цель изобретения - повышение чувствительности и точности способа, его упрощение.Способ осуществляют следующим образом.Предварительно адсорбированные пробы плазмы испытывают в трехкомпонентной серологической реакции нейтрализации антител с дозированным количеством специфической антисыворотки против фибронектина и стабильным диагностикумом, полученным в.результате последовательного сведения стабилизированных альдегидом эритроци(72) Н.Н.Н.Л.Кахновков и С.В(57) Иэобр 8.8)а,О. Ваеас, КЛатиачц - 1 1 шшппо 1 о 8ч. 79, р,65-70.ЕДЕЛЕНИЯ ФИБРОНЕКТИН не и может бьггь использовано для количественного определения фибронектина в плазме крови. Цель - повышениечувствительности, точности способа иего упрощение, В предварительно адсорбированные пробы плазмы крови вносят специфические антифибринонектиновые антитела, эритроцитарный диагностикум и по образованию агглютинатовопределяют содержание фибронектина,Эритроцитарный диагностнкум приготовляют из формалинизированных эритроцитов в присутствии дубильной кислоты. Сенситином является фибронектин,выделенный из крови человека или лошади,. В сравнепии с прототипом обеспечиваются чувствительность (болеечем в 70- 120 раз), точность способаи достигается его упрощение,тов, дубильной кислоты и фибронектина, с последующей фиксацией образовавшегося комплекса альдегидом.В предлагаемом способе испытуемые пробы плазмы, которые взаимодействую со специфической антисывороткой, а результат - нейтрализация антител - проверяются с помощью специфического стабильного фибронектинового эритроцитарного диагностикума, Срок хранения фибронектинового эритроцитарного диагностикума - 6 мес (срок наблюдения). П р и м е р. Испытуемые образцы плазмы крови разводят 1:2 - 1:4, соединяют со взвесью отмытых формалинизированных эритроцитов, инкубируют 1 ч в тепле и затем до утра на холоде3 14657для удаления гетерогемагглютининов.Такая обработка не снижает содержанияфибронектина в плазме,В качестве референс-препарата при 5меняют стандартный раствор фибронектина с концентрацией 450 мкг/мп, параллельно с испьггуемой пробой участвующий в определении содержания фибронектина. Антисыворотку получают путем гипериммунизации кроликов фибронектином.Для осуществления способа определения фибронектина в плазме крови готовят фибронектиновый эритроцитарныйдиагностикум; полученную кровь (барана, петуха, человека - 0 группы) дефибринируют, осадок эритроцитов отмывают изотоническим солевым раствором, затем ресуспендируют до 8 Е-ной 20концентрации, взвесь соединяют с равным объемом изотонического раствора,содержащего Зформальдегида, и инкубируют при 37 18 ч.Затем формалинизированные эритроциты отмывают изотоническим солевымраствором, доводят до 20%-ной концентрации таким же раствором с 0,3 формальдегида и оставляют на холодена несколько дней (полуфабрикат), ООСенситином служит фибронектин, выделенный иэ плазмы крови человека илиживотного (лошади) посредством афФинной хроматографии на желатин-агарозе с этапом дополнительной очистки .35элюата по известной методике.Полученные образцы Фибронектина вдозах 10, 25 и 50 мкг сводят с 5%-нойвэвесью эритроцитов (формалиниэированных, отмытых детергентсодержащим со,левым раствором (твин"80 1:50000) иобработанных дубильной кислотой (1::20 000.). Инкубирование фибронектина и эритроцитов при рН 6,4, 7,4,и 7,8, при 37 продолжают в течение1,2 или 3 ч или при 4- 18 ч, Сравнение серий, полученных при разных условиях изготовления, не выявляетразличий в характеристике конечногопродукта.50Эритроцитарный диагностикум стандартизируют по густоте на ФЭК-М иприменяют как 2,5%-ный в макро- икак 0,3 -ный - в микрометоде реакцицнейтрализации антител. 1Количественное содержание фибронектина плазмы крови определяют сравнением нейтралиэующего титра референс 69 4препарата и исслетуемой пробы плазмы крови по формуле;ХХ= Уу / Угде Х, У - концентрация Фибронектина в исследуемой плазмеи референс-препарате соответственно;Х ,7 - нейтрализующие титры.Воспроизводимость способа проверяют на 4 образцах плазмы, в которых определенно содержание фибронектина предлагаемым способом не менее 4 раз а использованием антисыворотки в разведениях от 1:160 до 1:51200 с интервалом в 1-2 дня. Полученные результаты совпадают (коэффициент корреляции 1,0 против О,9, в аналогичных опьггах, .в,прототипе).Предлагаемый способ определения фибронектина в плазме крови обеспечи-. вает по сравнению с известными способами следующие преимущества: большую специфичность за счет использования в качестве ингредиентов очищенного Фибронектина и специФической антисыворотки; большую результативность за счет выявления полимеров, мономеров и.продуктов деградации фибронектина; большую чувствйтельность за счет дозированного количества антител и прочности связи их с фибронектином; техническую простоту выполнения; высокую воспроизводимость результатов за счет использования стабильного эритроцитарного диагностикума единой активности и дозированных антител; доступность и экономичность (стоимость 1 анализа - около 1 коп.);уменьшение объема крови, достаточного для определения концентрации фибронектина (менее 10 мкл .)Повышение чувствительности дает применение дозированного количества специфических антител, минимального, но достаточного для осуществления способа. Точность повышается за счет реализации связывания многих мест связывания в молекуле фибронектина со специфическими антителами, что позволяет определить содержание всего иммунологически активного фибронектина, вплоть до гаптенов. Боль-. шая чувствительность обеспечивается также более прочной связью фибронектина в плазме крови с антителами по ,сравнению с желатиной и достигает 0,1-0,5 мкг/мл в предлагаемом способеЗаказ 938/44 Тираж 788 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент"., г, Ужгород, ул. Гагарина,01 5(7,0-60,0 мкг/ют по прототипу), В прототипе используют нативные эритро-; циты, что приводит к частому приготовлению и стандартизации субстратов реакции, что значительно усложняет5 определение фибронектина в клинике; в предлагаемом способе для этих целей применяют стандартные .формалинизированные эритроциты. О Эормула изобретенияСпособ определения фибронектина в плазме крови, включающий сенсибилиза 769 бцию эритроцитов белком, добавление их в исследуемую пробу с последующим определением по агглютинации эритроцитов содержания фибронектина, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с цельц повышения точности способа и его упрощения, эритроциты сенсибилизируют фибронектином, а перед добавлением их в исследуемую пробу ппазму адсорбируют несенснбилизированными эритроцитами и вносят специфические антитела.