Способ выделения фибронектина

(54) (57)ТИНА изхпоматог СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ .ФИБ ОНЕКиннойдставизокрови путе лазмыафиибой млатинвором л, 9 42В.Э. КотелянсСапожникова,И. Литвинов а сорбенте, пр трицу с иммоби й с элюцией фи и,яющем с анной ж оне ина рас мочевины, о т тем, что, с а и чистоты цчающ повышени ель диологическийССР вогоспольатидукта,т обраб качестве сорбента анные раствором ж тельно поперечнос ые глутаровым аль гранулы, а элюциюествляют растворо диенте концентрац 7,2-7,4,И., овй 1 цг К.А Р 245, 8.572 ы, предвар ктивирован елатиновые 1 итые гидомибромоА. Риг 1 К хс ВгосЬев.,1 337 ег тина осу ины в гр М при р р, 331е свидетС 01 И СССР 981. О,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОЧЙРЦТ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 567898/28-139.12,82(71) Всесоюзный канаучный центр АМН. доп оЕ ГЬгопесг 11979, 183, Р 23. АвторскоУ 984305, кл. и 33/50; с о 7 О 7/оо //61 К 37/ОгИзобретение относится к медицине,в частности к прикладной медицинскойбиохимии.Фибронектин представляет собойвысокомолекулярный белок плазмы крови и необходим для лечения обширныхтравм; сепсиса, ожогов, последствийобильных кровопотеоь, острых кишечных инфекций.Известен способ вьделения Фибронектина с помощью хроматографии наДЭАЭ-целлюлозе криопреципитата сыворотки крови, заключающийся в том,что свежую кровь свертывают при 37 С ,и центрифугируют при 3000-4000 об/мин,15отделившуюся сыворотку вьдерживают10 - 12 ч при 4 С. По истечении этого срока выпадает бельйхлопьевидный осадок, которыймногократно отмывают Физиологическим 20раствором и хроматографируют затемна ДЭАЭ-целлюлозе, отделяя фибронектин от сопутствующих белков 1.Указанная методика не дает возможности получить достаточно чистыйпрепарат Фибронектина, посколькукриопрецйпитат сыворотки содержитмножество белков, плохо отделяющихсяот фибронектина,Известен также способ выделения 30Фибронектина из плазмы крови путемаффинной хроматографии на нерастворимом сорбенте, представляющемсобой желатину, иммобилизованнуюна активированной бромцианом сефароэе с элюцией Фибронектина буферомили раствором аргинина. Метод основан на способности фибронектина специфически связываться с желатиной 23.40Недостатками способа являются невысокие выход белка (607) и чистота продукта,.а также контакт с высокотоксичным реагентом, каким является оромциан, используемый для. акти вации матрицы сорбента. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является способ вьде ления фибронектина из плазмы или сыворотки крови путем аффинной хроматографии на сорбенте, представляющем собой матрицу - активированную тионилхлоридом карбоксиметилцеллюлозу - с 55 иммобилизованной желатиной.с элюцией 4,0-4,5 М раствором мочевины при рН 7,4-7,5 3 1. Способ характеризуется недоста-точно высокими выходом и чистотойвьделяемого фибронектина (907).Цель изобретения - повышение выхода и чистоты целевого продукта.Указанная цель достигается тем,что по способу вьделения Фибронектинз из плазмы крови путем аффинной хроматографии на сорбенте, представляющем собой матрицу с иммобилизованной желатиной с элюцией фибронектина раствором мочевины,в качестве сорбента используют обработанные раствором желатины, предварительно попереченосшитые, активированные глутаровым альдегидом желатиновые гранулы и осуществляют эл акциюфибронектина раствором мочевины вградиенте концентрации 4-8 М прирН 72-7,4,Вышеприведенная совокупностьпризнаков способа обеспечивает болееполное сродство выделяемого белкас афинным сорбентом, более эффективные условия элюции, что, в конечномитоге, обеспечивает лучшие, по сравнению с известным способом, характеристики процесса выделения,В предлагаемом способе в качестве матрицы используют поперечносшитысжелатиновые гранулы, а желатину иммо.билизуют на них путсм инкубации ее1 Е-ного раствора с гранулами в течение 1-1,5 ч при 37-39 С и рН 7,2-7,4или в течение ночи при 4 . Затемсорбент отмывают от несвязавшейсяжелатины збуференным Физиологическимраствором рН 7,2-7,4 и блокируютсвободные альдегидные группы путеминкубации гранул в растворах 0,1 М .лизина или 1 М этаноламина, Послеотмывания гранул их инкубируют в 4 Ммочевине или 2 М КЬг в течение1,5 ч при 37-39 С, снова отмывают забуференным Физиологическим растворомрН 7,2-7,4 и используют для полученияфибронектина из плазмы,Матрицу для предлагаемого сорбента,т.е. гранулы поперечносшитой желатины, получают путем вливания 15 -20/-ного раствора желатины в 0,1 Мцитратном буфере рН 5,0 при 85-90 С вавазелиновое масло, нагретое до 75-80 С,с дальнейшим перемешиваниемдвухфазнойсмеси механической мешалкой при1500-1700 об/мин и последующим охолаждением смеси до 4 С. Образовавшиеся гранулы отделяют путем декантирования,промывают от масла гексаном илипетролейным эфиром при 4 С и обрабатывают сначала О, 5 раствором глутарового альдегида в течение 10-15 ч при 4 С, а затем 5 -ным раствором глутароового альдегида в течение 2-3 ч при рН 5,0 и 37 С,Поперечносшитые, активированные глутар овым альдегидом желатиновые гранулы тщательно отмывают забуференным физиологическим раствором вН 10 7,2-7,4.Выделение .фибронектина из плазмы проводят следующим образом.После отмывания полученного сорбента (желатины на желатиновых гранулах) забуференным физиологйческим раствором рН 7,2-7,4 на сорбент наносят свежую или размороженную плазму в отношении 10 мл плазмы на 1 мл сорбента и инкубируют смесь в течение 20 15-2 ч при комнатной температуре. Сорбент промывают Физиологическим раствором рН 7,2-7,4, чтобы удалить все несвязавшиеся белки плазмы. Элюцию фибронектина проводят градиентом 25 4-8 М мочевины в буфере, рН 7,2-7,4, Полученный белок диализуют против физраствора рН 7,2-7,4, концентрируют до 10 мг/мл и хранят до использования в течение двух недель при З 0 4 С. Более длительное время фиброонектин следует хранить при -20 С.Общий выход фибронектина - до 97 от среднего содержания в плазме. Достигаемая чистота 99%.На фиг. 1 приведен график элюции фибронектина с сорбента; на фиг, 2 . характеристика фибронектина на степень чистоты и гомогенности; на фиг. 3 - то же, иммунофореграмма40П р и и е р . 20 г желатины в 100 мл 0,2 М цитратного буфера рН 5,0 нагревают до 85 С к вливают в 0,5 .ч вазелинового масла, нагретого до 80 С. Смесь, помещенную в баню с тающим льдом, интенсивно перемешивают пропеллерной мешалкой 15 мин при 1700 об/минЗатем смесь о.стаивают и отсасывают масло. )КелатиновЫе гранулы трижды отмывают трехкратным объемом петролейного эфира или гексана при 4 С, затем заливают 200 мл 0,5 раствора глутарового 1124230альпегипа в 0,1 М цитратном буфере рН 5,0 и инкубируют. 10-15 ч при4 С, После этого концентрацию глу"тарового альдегида доводят до 5% иинкубируют смьсь 2-3 ч при 37 С,Поперечносшитые желатиновыегранулы, активированные глутаровымальдегидом, многократно отмывают забуференным физиологическим раствором рН 7,2-7,4 и затем смешивают сравным объемом раствора желатины(10 мг/мл) в том же буфере, Смесьперемешивают в течение ночи при4 С или в течение 1,5 ч при 37 С,Затем гранулы многократно отмываютот несвязавшегося белка забуференНым физраствором и суспендируют в200 мл О, 1 М лизина или 1 М этаноламина в течение 2 ч при 37 С. Послеэтого суспензию инкубируют 1,5 чпри 370 С в 4 М растворе мочевины,трижды отмывают пятью объемами забуференного физраствора рН 7,2-7,4 ииспользуют для получения фибронектина из плазмы крови человека.100 мл свежей или размороженнойплазмы добавляют к 10 мл приготовленного сорбента и инкубируют смесьпри комнатной температуре в течение1,5 ч, Сорбент промывают эабуференным физиологическим раствором, чтобыудалить все несвязавшиеся белки плаз.мы. Элюцию фибронектина проводятградиентом 4-8 М мочевины в буферерН 7,2-7,4. Полученный белок диализуют в течение 36 ч против забуференного физиологического раствора прирН 7,2-7,4, концентрируют до 10 мг/млои хранят до использования при 4 Св течение 12 дней или дольше при-20 С. Выход 97%.Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с изв"стным обеспечивает повышение выхода в среднемдо 977, Уровень исходного фибронектина в плазме подвержен резким колебаниям (180-600 мг/л), однако емкостьсорбента такова, что позволяет заодин шаг иммуносорбци. произвестиисчерпывающее извлечение фибронектина.Результаты выделения фибронектинаприведены в табл. 1.Исходное содержание Фибронектина в плазме, мг/л Партиясорбируемой плаз 225 97,8 230 420 410 97,6 98,3 305 300 190 98,4 187 280 270 96,4 Выделенный по предлагаемому способу фибронектин (препарат) характеризуют на степень чистоты и гомогенности следующими методами: аналитическим ультрацентрифугированием;диск-злектрофорезом в полиакриламидном геле; иммунозлектрофорезом; детекцией эффекта на адгеэию и рас пластывание клеток.В результате в ИЯ-электрофорезев полиакриламидном геле показана гомогенность фибронектина, что согла- ,суется с, данными 2 3 (Фиг, 2 А), Чистота препарата 99%.Аналитическое ультрацентрифугирование (Фиг. 2 В) в диапазоне 14-17 ед.ЗСведберга (Я) также свидетельствуетоб отсутствии загрязнения препаратаиными макромолекулами,На иммунофореграмме (Ьиг. 3),.проявленной антисывороткой к сыворо бточным белкам человека (1) и моноспецифической антисывороткой к фибронектину (1 О, показана серологическаягомогенность фибронектина (НФ,3,0 мг/мл) и отсутствие загрязненияиными плазменными антигенами,Поверхность гезия, Расплас% тывание,%Коллаген Таблица 3 Партии фибронектина Среднее из трех партий Фибриноген 11,5 9,0 15,5 12,0 0,24 Продукты деградации фибриногена 2,3 4,3 6,0 4,2 0,084 аименование примесных белков Дипопротеиды низкой плотности Количество выделенного фибронектина В табл. 2 приведены данные по биологической активности Фибронектина (адгезии и распластываниюклеток на . поверхности, покрытой коллагеном)Таблица 2 Коллаген, обработанный фиброкектином 88 Данные говорят о том, что основные характеристики биоактивности фибронектина сохранны (повышение адгезии клеток на 70% и распластывание на 35%) по сравнению с контролем.Данные иммуноферментного анализа примесных белкоуГ в препаратах фибронектина, полученных предлагаемым способом приведены в табл. 3. 3 мг/мл % от среднего содер- жания1124230 попротеиды высокой плотности Иммуноглобули С,019 3 0,0 дь глоб эритроцитарныи г угие сывороточные белк леды лед Предлагаемый способ позволяетдостаточно простым методом извлечьиз нлазмы крови с высоким выходом. и высокой степенью чистоты фнбронектин, являющийся ценным лечебнымпрепаратом. ваКорректор И Скородвич оставитель ехред Ж.Каст 1.Рыбчен Редак 34 Тираж 822ВНИИПИ Государственного комитета ССпо делам изобретений и открытий13035, Москва, Ж, Раушская наб.,аказ 82 но атент.", г. Ужгород, ул. Проектна лиал М А