Способ определения активности моноаминоксидазы в тромбоцитах

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН А в С 01 Н 33/48 ЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТЮ ЛИСАНИЕ ИЗОБ ВТОРСМОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(46) 07.05.84. Бюл. В 17 (72) А,З. Дроздов и Б.М. Коган (71) Всесоюзный ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт общей и судебной психиатрии им. В.П. Сербского (53) 616.89(088.8)(56) 1. Мс. Еътеп.,СЬ. М. Со 1 еп С.В. Ап ааи.пе охЫаве хп погша 1 Ьишап.- Л. ЬаЬ. СЬ 1 ш. Мед.", 62(Б), 766- 7761 1963,2. ЕаьСвц К., Иаяа Н., ОМвцЬо К,еВ аТ. "А Яепв 11 че Р 1 цогошейгс Аввау оГ Нцшап", Р 1 айе 1 е Мопоашдпе Ох 1 даве ЗпЬ 1 Ь 1 ог. - Селеш. Р 1 атш. Вц 11.", 1978, 26, р. 3471- 3476 (прототип).(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЕНИЯ АКТИВНОСТИ МОНОАМИНОКСИПАЗЫ В ТРОМБОЦИТАХ, включающий инкубацию их в присутствии бенэиламина с последующим спектрофотометрическим определением концентрации образовавшегося бензальдегида, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности, бензальдегид экстрагируют И -гептаном в соотношении (1:2,1)-(1:2,6), экстракт хроматографируют при ско" рости протока элюента 1,9-2,1,мл/мин, а в качестве элюента используют смесь этанола с водой в соотношенииИзобретение относится к медицине,в частности к ферментному анализукрови человека, и может быть использовано в медицинской практике приизучении биохимических показателей 5крови в клинике и эксперименте.Известен способ флюорометрического определения активности моноаминоксидазы (МАО) в тромбоцитах путеминкубирования исследуемого ферментас субстратом. Определение проводится в 0,2 мд крови после инкубацииреакционной смеси в течение 1 чнри 37 С 11.К недостаткам известного способаотносятся малый диапазон линейности,низкая специфичность. Кроме того,использование в качестве реагенФа1,2-диаминонафталина - вещества ссильными канцерогенными веществами,придает способу большую травматичностьИзвестен также способ спектрофотометрического определения активности фермента, включающий экстракцию25бензальдегида циклогексаном с последующей детекцией при 242 нм Ы .Недостатком известного способаявляется относительно низкая точность,ЗОЦель изобретения - повышение точности способа.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения активности,моноаминоксидазы в тромбоцитах, включающему инкубацию их в присутствии бензиламина с последующим спектрофотометрическим определением концентрации образовавшегоЩ ся бензальдегида, бензальдегид экстрагируют н-гептаном в соотношении (132,1) " (1:2,6), экстракт хроматографируют при скорости протока элюента 1,9-2,1 мл/мин, а в качестве элюента используют смесь этанола с водой в соотношении (58:42)-(62:38).Способ осуществляют следующим образом.50Тромбоциты выделяют из 10 мл кро- ви, взятой из локтевой вены в пластиковые стаканчики, куда предварительно добавляют 0,3 мл 0,27 М ЭДТА-буфера рН 7,4,. Эритроциты и лейкоциты осаждают центрифугированием крови в течение 5 мин при 300 г Надосадок повторно центрифугируют 20 мин при 2000 я. Осадок суспендируют и гомогенизируют в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,65. Гомогенат центрифугируют при 20000 е 20 мин. Осадок суспендируют и гомогенизируют в 0,2 М фосфатном буфере рН 8,4. В реакционную среду отбирают 0,1 мл суспензии.Количество белка определяют по методу Лоури и добавляют.0,4 мл 0,2 М К-Ма фосфатного буфера рН 8,4. За,тем к реакционной смеси добавляют 0,1 мл (12 ммоль) раствора бензиламина и пробы инкубируют при 37 С в течение 10 мин при постоянном встряхивании. Реакция останавливается 0 мл 207 ТХУ, Вслед за этим в реакционную смесь добавляют гептан в отношении 1:2,1-1:2,6. Пробирки интенсивно встряхивают в течение 3 мин и центрифугируют при 1500 я 15 мин. Органическую фазу переносят в пузырьки автоматического пробоотборника, откуда она поступает в петлю хроматографа (жидкостный хроматограф высокого давления Апа 1 узй, фирмы ЬЭС). Объем вводимого в колонку с обращенной фазой (250"4,6 мм ЗрегдзогЬ ОПЗ) раствора равен 20 мкл. В качестве подвижной фазы используют смесь этанола с водой в соотношении 58:42-62:38. Скорость протока элюента 1,9-2,1 мл/мин.П р и м е р 1. Испытуемый М. Взятие пробы крови, выделение тромбо-: цитов, инкубация их с бензиламином производится описанным способом. Образовавшийся бензальдегид экстрагируют Н -гептаном (1:2,1), затем хроматографируют при скорости протока 1,9 мл/мин. В качестве подвижной фазы используют смесь этанол-вода (58:42). При этом удельная активность фермента составила 73,33 ммоль/ч/мг белка.П р и м е р 2 Испытуемый В Взятие пробы крови, выделение тромбоцитов, инкубация их с бензиламином проводится описанным способом. Образовавшийся бензальдегид экстрагируют Н -гептаном (1:2,6), затем хроматографируют при скорости протока 2,1 мл/мин. В качестве подвижной фазы используют смесь этанолвода (62;38), при этом удельная активность фермента составила 65,28 ммоль/ч/мг белка.3 1091071 1Использование предлагаемого спосо анализа до 943. Кроме того, способ ба определения активности МАО в тром прост в использовании, не требует боцитах позволит повысить точность малодоступных химических реактивов.Составитель Е. ЖитниковаРедактор Л. филь Техред А,Ач Корректор, М. ШарошиЗаказ 304/41 Тираж 823 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и.открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д,. 4/5 филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4