Способ определения кислородных радикалов, образуемых фагоцитами

,10 3/48 А С 01 10 0 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(56) серег Е хе 1 С дп Ьд РЬоСо Вогз У., Вагап , МдсЬе 1 С Гцс Рейесй 1 оп оЕ о 1 о 8 дса 1 геассопдо 1., 28, 1978, Раг 1 с В.Н., РИсг 1 .М, 1 пЕесйоп ап о 11 нш гейисйзопдд, 1968, 532. е 1., Ьеп 8 С., Рг реп гад РЬойос 9-639. З.М., В пдйгоЬ 1 Ьу пепи епса 1 вЬеш. вояюте шйЬцегор И 1 з 2. юдс 1 с Е семгах Ьапсе СУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬГГИИ 3474361/ 28-1316.07.8207.05.84, Бюп. У 17И.Б,Збарский, В.М.Земсков, Морозов, А,В.Пескин и А.В.Храм Научно-исследовательский инсиммунологии АМН СССР, Инстит гии развития им. Н.К.Кольцоваь титут питания АМН СССР 611-018-53(088.8)(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОРОДНЫХ РАДИКАЛОВ, образуемых фагоцитами,включающий выделение клеток, смешивание их с фагоцитируемыми частицами,добавление соли тетразолия и инкубацию реакционной смеси с последующейрегистрацией кислородных радикалов,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повышения его точности, вкачестве контрастного вещества используют 150-250 мкМ тетранитросинего тетразолия, затем в ряд реакционных смесей дополнительно вводят супероксиддисмутазу от 1, 1 мкг/мл дообразования формазана, а количесткислородных радикалов (У) определпо формулеУ = -0,267 + 0,242 Х,где Х - количество супероксиддисмутазы, находящейся в пробе с образовавшимся формазаном, мкг/мл.Изобретение относится к медицинеи может быть использовано для диагностики иммунодефицитньпс заболвваний.Известны способы определения образования кислородных радикалов путем использования маркировочноговещества, при взаимодействии которого с кисЛородными радикалами меняются спектральные характеристики 1 3,Однако чувствительность измеренийуказанным способом низка и позволяет регистрировать суммарно образование кислородных радикалов толькоот значительного количества клеток.Известен также способ определения кислородных радикалов, образуемых фагоцитами, включающий выделение клеток, смешивание их с фагоци.тируемыми частицами, добавление соли тетразолия и инкубацию реакционной смеси с последующей регистрацией кислородных радикалов, для чегов суспензию, содержащую фагоцитыи фагоцитируемый материал - дрожжевые 25клетки, одномоментно вводят нитросинийтетразолий и после инкубации материал просматривают в световой микроскоп,По выпадении нерастворимого темносинего осадка определяют количество об-ЗОразовавшихся кислородных радикалов 2 3Однако нитросиний тетразолий является пригодным только для световоймикросокпии, так как получаемый с результате его восстановления продуктобладает слабой электронной плотностью.,Кроме того, способ на основесветовой микросокпии является неточным, позволяет получить лишь данныео наличии или отсутствии продукта 40реакции, не позволяет связать образо"вание этого продукта (а следовательно, и кислородных радикалов) с определенными субклеточными образованиями, что чрезвычайно важно для точно.го описания места и момента выработки фагоцитом кислородных радикаловдля диагностики иммунодефицитныхзаболеваний,Цель изобретения - повышение точности способа.Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу определения кислородных радикалов, образуемьос фагоцитами, включающему выделение клеток, смешивание их с фагоцитируемыми частицами, добавлениесоли тетразолия и инкубацию реакционной смеси с последующей регистрацией кислородных радикалов, при котором в качестве контрастного вещества используют 150-250 мкМ тетранитросинего тетразопия, затем в рядреакционных смесей дополнительновводят супероксиддисмутазу от1, 1 мкг/мл до образования формазана, а количество кислородных радикалов (У) определяют по формулеУ = -0,267 + 0,242 Х,где Х - количество супероксиддисмутаэы, находящейся в пробе с образовавшимся формазаном, мкг/мл.Способ осуществляют следующимобразом.Полученные фагоцитирующие клеткив конечной концентрации 1-106 -3 10 мл вносят в содержащую фагоциЬтируемый материал инкубационную среду следующего состава: 120"160 мйхлорида натрия 3-7 мМ хлорида калия,15-25 мМ В-(2-гидроксиэтил) -пиперазин-Ю-этаносульфоновой кислоты(НЕРЕЯ), 3-7 мМ глюкозы, 150-250 мкМтетранитросинено тетразолия, имеющую РН 7,0-7,2.После инкубации в течение 15 -60 мин клетки осаждают центрифугированием, фиксируют 47.-ным раствором параформальдегида на 100 мМ какодилатном буфере, постификсируют 1 Х-нымраствором четырехокиси осмия на75 мМ какодилатном буфере, обеэвоживают ацетоном с возрастающей концентрацией последнего от 70 до 1007, заливают в смесь эпон-аралдит, полимеризуют в течение 48-60 ч, ультрамикротомируют и изучают в электронноммикроскопе.Указанные величины .тетранитросинего тетразолия являются оптимальными, так как превышение верхних пределов может приводить к неспецифичес- коМУ выпадению осадка, а нижние зна-чения являются теми минимальными количествами, которые достаточны для визуализации осадков в электронном микроскопе. Концентрационные значения хлорида натрия, хлорида кания, НЕРЕЯ и глюкозы являются минимально необходимыми для создания в среде инкубации условий для поддержания жизнедеятельности фагоцитов: изотоническое давление и рН.В реакционную систему вводят разЛичные .количества супероксиддисмутазы. Далее определяют концентрацию супер10910 Составитель Е.Житникова Техред Ж,КастелевичКорректор В,Бутяга Редактор Л,Филь Заказ 3073/40 Тираж 823 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-.35, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г.Ужгород, ул.Проектная., 4 оксиддисмутазы, при которой происходит образование диформазана, и поприведенной формуле рассчитывают количество кислородных радикалов, образуемых на субклеточном уровне, 5П р и м е р. Фагоциты, полученныестандартно из брюшной полости мышей,инкубируют в НЕРЕЯ - забуференнойсреде,. содержащей, 140 мМ ИаС 1,5 мМ КС 1, 20 мМ НЕРЕЯ ТрН 7,2), 105 мМ глюкозы, 223 мкМ тетранитросине"го тетразолия, В качестве фагоцитируемого материала, используют опсонизированные кроличьей антнсывороткойдрожжевые клетки СапйЫа а 1 Ъсапз. 15Время инкубации 30 мин при 37 С ипостоянном встряхивании.Для количественного определениякислородных радикалов на субклеточном уровне строят калибровочную кри- гОвую. В НЕРЯ-забуференную среду вносят ксантин (2 10 1 М) .и различныеколичества ксантиноксидаэы, что приводит к регистрируемым спектрофотометрически различным скоростям образования супероксидных анионов. Длякаждой из скоростей образования экспериментально определяют различныевеличины их ингибирования определенными количествами супероксщдисму- ЗОтазы, после чего математически рассчитывают те количества супероксиддисмутазы, которые вызывают для каждого уровня образования супероксидтных анионов максимальное ингибирование восстановления тетранитросинего 70 41 гетразолия, детектируемое электронныммикроскопом. В таком случае уравнение регрессии имеет следующий внд:У = -0,267 + 0,242 Х (г=0,97).,где Х - количество супероксиддисмутазы, мкг/мл, У " количество кислородных радикалов, ммоль/мин, Вводяв среды инкубации, где содержатсяфагоциты и фагоцитируемые частицы,различные. количества супероксидцис-мутазы, можно количественно определять кислородные радикалы на субклеточном уровне, Обработанные фагоцитыполимеризуют в течение 48 ч при 60 С,Ультратонкие срезы получают на ультрамгкротоме фирмы 1.КВ (Швеция).Материал просматривают в электронноммикроскопе Н("Н.асЬх", Япония).Результаты, получаемые с помощьюпредлагаемого способа отличаютсявысокой. точностью, что подтверждаетсяотсутствием неспецифических осадков,отсутствием различий в многочисленных сериях опытов и большим обьемомпроведенных экспериментальных исследований,Предлагаемый способ позволяетболее точно, на субклеточном уровнерегистрировать образование кислородных радикалов, что необходимо длядиагностики иммунодефицитных заболе"наний. При этом расширяется областьприменения способа, поскольку описанные процедуры позволяют проводитьисследования как в световом, так ив электронном микроскопе.