Способ определения активности каталазы в плазме крови

СОЮЗ СХ:ВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 821 А 1 ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ П 1 НТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ 831/14688 44 06. 0 23. 0 11 юи, Ь 3иохими АН ЬССРударственцый ме Институт ецский г институтВ.С, Васильев, Г,КЧернкевич, Ф,С. ЛЦыркуцов11 абораторцое дело,с. 16-19.ь вц 1988,(54) СНОСОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВКАТАЛАЗЫ В 1 ШАЗМЕ КРОВИ тиостся к биохимии(57 эобретеци цине и по ть катала воляет определ ы плазмы крови и мы крови,тивн носится к биохимиит быть использованоклинике для опредекаталазы плазмы кро Изобретение о едицине и мож эксперименте ения активцостЦель изобретения - сокращение времени и создание возможности определения активности каталазы в плазме при гипербилирубинемии.Способ осуществляется следующим образом.Веноэную кровь (3 мл) центрифугируют 1 О мин прн 3000 об/мин, при этом в качестве антикоагулянта используют гепарин иэ расчета 50 ЕД/мл крови, Для приготовления стандартного образца к О, 1 мл плазмы крови добавляют 0,1 мл раствора аэида натрия 0,2-2%- ной концентрации и 2 мп 0,03%-ного(21) (22) (46) (71) Грод ский (72) И.Ии В. (53) М 1,ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ ме и при гипербилирубицемии. Цельизобретения - сокращение времени определения при одновременном созданиивоэможности определения активности каталазы в плазме ири гипербилирубинемиц, Готовят стандартную и исследуелую пробы. В стандартную пробу к плазме крови добавляют в коцечцой концентрации 0,009-0,09%-цый раствор азиданатрия и перекись иодорода, а в исследуемую пробу - перекись водорода.После ицкуба;иц ц течение 55-60 с висследуемую иро(у плазмы крови вносятазид натрия, а затем в обе пробымолибдат аммония. Спектрофотометрически определяют р;зцость экстицкций ирассчитывают активность каталазы плазраствора перекиси водорода (Н О ) Висследуемои пробе к 0,1 мл плазмыкрови добавляют 2,0 мл 0,03%-ногораствора НО . Обе пробы ставят цаинкубацию при 25 С на 55-60 с, Послеминутного ицкубнровация в исследуемуюпробу добавляют О,1 мл раствора азиданатрия 0,2-2%-ной концентрации сцелью ингибирования реакции разложения ИО каталазой плазмы крови (конечная концентрация аэида 0,009-0,09%).В стандартную и исследуемую пробывносят 1,0 мл 4%-ного раствора молибдата аммония, который с непрореагировавшеи НО образует окрашенный комплекс. Интенсивность цветной реакцииизмеряют спектрофотометрически на приборе "Вресо 1 21" (ВНР) при длине волны 410 нм. Определяют разницу экстинк 1622821ции между стандартной и опытной пробаии и производят расчет активности каталаэы плазмы крови по формулеЬЕМК Я с где А - активность каталазы,мкмоль с лЕ - разность экстинкций контрольной и опытной проб;Ч - объем пробы, мл (3,2);К - коэффициент пересчета на 1 л1 азмы крови (10000);Я - коэффициент молярной экстинкции перекиси водорода,икмоль (22,2);время инкубации проб, с (60),Для определения оптимальной ингибирующей концентрации азида натрия 20(в О, 1 мл раствора) проведено исследование, результаты которого пока зывают, что 0,27-ный раствор азиданатрия обладает максимальной ингибирующей способностью и превышение укаэанного верхнего предела концентрации азида натрия не приводит к большему угнетению активности фермента, авлечет повышенный расход данного реактива, Использование концентрацийазида натрия меньше 0,27. приводит кснижению ингибирования каталазы, Слдовательно, 0,2-27.-ный раствор азицанатрия являегся оптимальной концентрацией данного вещества в целях достаточного угнетения каталаэы плазмы крови (конечная концентрация азида0,009-0,097,).Проведенное изучение выраженностиингибирующего эффекта азида натрия показывает, что полная каталазная активность плазмы крови (без добавленияазила натрия) равна 0,50 ++ 0,003 мкмоль с л , что составляет3,347. от полной, Следовательно, выраженность ингибирующего эффекта азиданатрия на каталазу плазмы крови достигает 96,667Для выбора оптимального времениинкубации изучена кинетика активности каталаэы. Линейная зависимостьактивности фермента от времени инкубации "охраняется в течение 55-60 с,При дальнейшем увеличении времени инкубации скорость разложения перекисиводорода каталаэой плазмы крови постепенно снижается. Сокращение времени инкубации менее 55 с ведет к уменьшению разницы экстинкций контрольной иопытной проб, а при увеличении времени инкубации более 60 с зависимость активности каталазы от времени инкубации теряет линейный характер,П р и м е р 1, 3 мл веноэной крови практически здорового человека (общий билирубин 14,7 мкмоль/л), взятой с использованием гепарина из расчета 50 ГД/мл, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин, Полученную плазму крови отсасывают в чистую пробирку, Цля приготовления стандартного образна к 0,1 мп плазмы добавляют 1),1 мч 0,27.-ного раствора аэида натрия (конечная концентрация О,ООц),) и 2 мл О,)ЗХ-кой перекиси водорода. В исследуемой пробе к 0,1 мл плазмы крови - 2,0 мл 0,03.,-кого раствора перекиси водорода (ИО, ), 1)бе пробы ставят на инкубацию при 25 С ка 60 с. После ныдерживания 1 мин при этол температуре н исследуемую пробу добянляют 0,1 мл 0,27.-ного раствора азидя натрия. Затем как н стандартную, тяк и н исследуемую пробы вносят по 1,) мл ць-ноо раствора модкбдята амокия, После 2-.апутного центрифугиронания при 3000 об,/мин измеряют экстиккцию стакдарткоп и опытной проб на спектрофотометре "Ыресо 1 21" (1 НР) при длине волны 410 нм. Разница экстинкцийЬ 1,) межцу контрольной и опытной пробами в конкретном случае равна 0,042. Используя указанную формулу, определяют активность каталазы плазмы крови: ЬК Ч К -1А = в в= 1 009 мкиоль с л . Я1П р и и е р 2. Взятие крови и получение плазмы крови здорового человека проводят идентично примеру 1 Для приготовления стандартной пробы к 0,1 мл плазмы крови добавляют 0,1 мп 17-ного раствора язида натрия (конечная концентрация 0,0457) и 2,0 мп 0,037.-ного раствора П О. Исследуемую пробу готовят как в примере 1, Обе пробы ставят на инкубацию при 25 С на 58 с, После инкубации в исследуемую пробу добавляют 0,1 мл 13- ного раствора аэида натрия, Затем в стандартную и опытную пробы вносят по 1,0 мл 4 Т-ного раствора молибдата аммония, Последующие операции прово5 162 дят как в примере 1, Разница экстинкций между стандартнои и исследуемой пробами в данном случае 0,040. Активность каталаэы плазмы крови 2821 51 О П р и м е р 3. У здорового человека проводят забор веноэной крови и выделяют плазму как в примере 1. Для приготовления стандартной пробы к 0,1 мл плазмы крови добавляют 0,1 мл 27-ного раствора азида натрия (конечная концентрация 0,092) и 2,0 мл 0,03/-ного раствора НО, Исследуемую пробу готовят как в примере 1, Обе пробы ставят на инкубацию при 25 С на 55 сосле инкубации в исследуемую пробу добавляют 0,1 мл 2/-ного раствора азида натрия, В стандартную и опытную пробы вносят по 1,О мл 4 У.-ного раствора молибдата аммония, Последующие операции проводят как в примере 1. Разница экстинкции между стандартной и исследуемой пробами в данном случае 0,038, Лктивность каталазы плазмы крови 15 20 П р и м е р 4. У больного стеднетяжелой дормой вирусного гепатита В(общий билирубин плазмы крови129,4 мкмоль/л) проводят забор крови и выделение плазмы способом, описанным в примере 1. Для приготовления стандартнои пробы к 0,1 мп плазмь.крови добавляют О, мл 0,2 д-ного раствора азида натрия и 2,0 мл 0,037.-ного раствора Н О, Исследуемую пробуготовят как в примере 1, Обе пробы ставят на инкубацию при 23 С на 60 с. После инкубации в исследуемую пробу добавляют 0,1 мл 0,2 Х-ного раствора азида натрия, В стандартную и опытную пробы вносят по 1,0 мл 4/-ного раствора молибдата аммония, Последующие операции проводят как в примере 1. Разница экстинкцчи между стандартной и опытнои пробами в данном случае 0,08, Активность каталазы плазмы кро- ви плазмы крови 45 50 55 АЕ Ч К-1А = в- = 0 994 мкмоль с лЕг.ЬВ Ч Кв ( -1А = -= = 0 990 мкмоль с иСгФ 11 Е Ч К - -1А =- = 1,92 мкмопьс лЕр и м е р 5. У больного среднетяжелой формой вирусного гепатита В(общий билирубин плазмы крови 25 30 35 40 129,4 мкмоль/л) проводят забор кровии вьделяют плазму как в примере 1,11 ля приготовления стандартной пробы к О, мл плазмы крови добавляют 0,1 мл1 Е-ного раствора азида натрия и 2,0 мл0,03%-ного раствора НО, Исследуемую пробу готовят как в примере 1. Обепробы ставят на инкубацию при 25 С на58 с, После инкубации в исследуемуюпробу добавляют 0,1 мл 1/-ного раствора азида натрия, В стандартную и опытную пробы вносят по 1,0 мп 47.-ногораствора молибдата аммония. Последующне операции проводят как в примере1, Разница зкстинкций между стандартнои и опытной пробами в данном случае0,077. Лктивность каталазы плазмыкрови 6 .- 1 Л; ---- = 1 91 мкмоль с л Ф11 р и и е р 6У этого же больногопроводят взятие крови и получениеплазмы крови как в примере 1, Для приготовления стандартной пробы к 0,1 млплазмы крови добавляют 0,1 мп 2/-ноо раствора азида натрия и 2, С мл0,03/-инго раствора Н О, Исследуемуюпробу готовят как в примере 1, Обео,пробы ставят иа иикубацию при 25 Сна 5 э с, 11 осле инкубации в исследуемую пробу добаqлнют 0,1 мл 22-ногораствора азида натрия. Затем в обепробы вносят ио 1,0 мл 4 Е-ного раствора мплибдат аммония, Последующиеоперации осуществляют как в примере 1,Разница экстиикций между стандартнойи исследуемои пробами в данном случае О, 073, что позволяет определитьактивность каталазы Ь 1:ЧК А == 1,91 мкмольс лИспользуя известный и предлагаемый способы изучена активность каталазы крови больных вирусным гепатитом В (ВГВ) различной степени тяжести и практически здоровых доноров в сопоставлении с уровнем билирубинемии, Исследования, аналогичные предлагаемому способу, проведены с использованием и других известных ингибиторов каталаэы.Результаты определения активности данного фермента с применением в качестве ингибиторов азида натрия и цивеща калия приведены в таблице,1622821 Средняя форТяжелая форма(и = 8) Больные ВГВлегкая форма(п=14) Показатель ма (п.=19) Общий билирубин,м кмоль/лАктивность каталазы, мкмоль с 1 лПредлагаемый способс использованием Ф192,4+21,7+1,91+0,13 2,42+0,18 1,01+0,О 7 1,44+0,094 азида натрияПредлагаемый способс использованием+ 11 остонерные раз шчия показателей по отношению к контролю (р ( 0,05),11 олученные данные свидетельствуют о практической идентичности активности каталазы в одинаковых группах обследованных лиц при использовании различных ингибиторов предлагаемого способа (учитывая очень высокую токсичность цианида калия, в лаборатор,нои практике следует отдать предпочтение азиду натрия), 10Используя предлагаемый способ в плазме крови больных ВГВ средней и тяжелой формами активность каталаэы была значительно повышена, однако при известном способе такого повыше ния обнаружено не было, что указывает на неадекватность известного технического решения,Существенно, что у отдельных больных с высокой билирубинемией опреде лить активность каталазы плазмы крови известным способом оказалось невоэможным, что подтверждается следующим наблюдением,П р и м е р 7. Больная Ч., 48 лет, 25 находилась на лечении в Гродненской областной инфекционной больнице в 1988 году. Биохимическое исследование крови показало, что уровень общего билирубина равен 260 ммоль/л ч 30 (норма - до 20,5), активность аланинамйнотрансферазы 4,5 ммоль/л ч (норма - до 0,7), обнаружен поверхностный антиген вируса гепатита В, Поставлен диагноз: вирусный гепатит В, тяжелая 35 форма, При использовании известного способа определение активности ката- лазы провести не удалось, поскольку экстинкция (0,475) холостой пробы (с максимальной концентрациеи окрашенного 10 комплекса перекиси воДорода с молибдатом аммония) оказалась меньшеэкстинкции опытной пробы (0,684),содержащей плазму крови больной Ч,Однако предлагаемым способом активность каталазы была успешно определена (2,16 мкмоль с , л ),Таким образом, предлагаемый способобеспечивает по сравнению с известнымсокращение срока инкубации в 10 раэ,тем самым в 3 раза уменьшая длительность определения, более высокую специфичность и адекватность исследования: за счет создания воэможности определения активности каталаэы в плазме крови при гипербилирубинемии,формула и з о б р е т е н и я Способ определения активности ката- лазы в плазме крови путем инкубации контрольной пробы, содержащей перекись водорода, и опытной пробы содержащей плазму и перекись водорода, с последующим добавлением к обеим пробам молибдата аммония и регистрациеи оптической плотности, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью сокращения времени при одновременном создании воэможности определения при гипербилирубинемии, в контрольную и опытную пробы дополнительно вводят азид натрия в конечной концентрации О,ОО 9-0,09%, причем в контрольную про;бу азид натрия вводят перед началом инкубации, в опытную пробу - после окончания инкубации перед введением молибдата аммония, а инкубацию проводят в течение 55-60 с.