Способ получения -лактамазы

(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕ путем культивирования п б.соЬ, содержащего плаз с фагом, о т л и ч а ю тем, что, с целью повьппи )-лактамазы, фаг % АрЯК культуруЕ,собИ 3101 гес причем используют фаг52, множественностью от 1 д корпускул на клетку.(71) Институт молекулярной биолои генетики АН УССР(56) 1. Доклады АН СССР, 1980, йй 4, с. 995-998.2, Авторское свидетельство СС,по заявке В 3435949/13,кл. С 12 Ц 9/38, 11.02.83 (прото ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕ ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОПИСАН К АВТОРСКОМ НИЯ Р-ЛАктАМАЗЫодуцентамиду рВК 322,ийсяния выходавносят вА" 13 акиро,АрФ с20 фаговых20 Цель изобретения - повышение выхода-лактамазы.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения-лактамазы путем культивирования продуцента Е. соЬ содержащего плазмиду рВВ, 322, с фагом, фагАр( В. вносят в культуру Б,соб 43101 наес 113 р, причем используют фаг 3 АрЯ К с множественностью от 1 до 20 фаговых корпускул на клетку.Способ осуществляют следующим . образом.С помощью фага Я переключают белковый синтез с бактериальной хромосомы на геном фага и геном плаэмиды. При этом в составе генома 45 Изобретение относится к получению белковых продуктов, напримерферментов иэ микроорганизмов, и:может быть использовано для получения биологических активных веществ, 5а частности фермента-лантамааы,из микроорганизмов в промышленныхмасштабах, а также для повышениябиосинтеза продуктов рекомбинатныхмолекул ДНК плазмид при тестированин экспрессии последних.Известен способ получения биологически активного вещества на основемногокопийных плазмид, содержащихген, ответственный за синтез за 15данного продукта. Фрагмент ДНК сгенами рестриктазы и метилазы ЕсоВ,11встраивают в мультикопийный вектор,который обеспечивает как увеличениеколичества копий рекомбинатнойплазмиды до 10, так и более эффективную экспрессию клонированныхгенов ферментов, причем плаэмидная ДНК обеспечивает повышенныйсинтез Фермента в 3 раза по срав 25нению с исходным уровнем И .Недостатками данного способа является то, что после процесса амплиФ.,ации антибиотики необходимоудалять иэ культуральной среды,поэтому является нетехнологичным.Наиболее.близким к предлагаемомуявляется способ получения Р -лактамазы, включающий выращивание культуры Е,соб с 600, содержащей плазмиду рВВ. 322 и последующее введение в эту культуру фага Яс 857с мутациями в генах Я и К 2 .Недостатком известного способаявляется невысокий выход фермента Р:о 40 фага и в составе генома плазмиды содержится ген, отвечающий за синтез, интересующего нас продукта. В частности используют фаг, содержащий в своем составе ген Ар, отвечающий на синтез фермента (3 -лактамазы, разрушающего антибиотики с-лактамным кольцом, который по предлагаемому способу должен содержаться и в геноме плазмиды.В качестве бактериальной культуры, содержащей плазмиду рВК 322 и подвергающейся заражению фагом 3 с Ар"агентом, используют Е.со Р Ю 3101 Рес А 13 ир. Используют эту культуру из-за снижения частоты рекомбинации между гомологичными последовательностями фагаи плазмиды рВ 322, имеющими место в виде Ар-гена. Мутация в гес А-гене это условие выполняет.1Культуру Е.соб 63101 наес А 13 бн с плазмидой рВК 322 выращивают до плотности 1 МО клеток в81 мп при 37 С и доводят до постоянной скорости роста, затеи заражают фагомс Ар-геном в соотношении 10 фаговых корпускул на 1 бактериальную клетку, инкубируют 2,5-3 ч при 37 С, а затем инкубнруют 14 -О15 ч при 28 С,. Инкубирование культуры, зараженной Фагом 3 , при 28 С способствует замедлению лизиса клеток так как оптимальной для разЭовития фага является 37 С. Замедление лизиса клеток способствует накоплению /3 -лактамазы, для чего используют ааЬег -мутации в Фаговых генах 0 и К. Ген Я является регуляторным геном, отвечающим за включение поздних генов фага, среди которых находится и ген К, продукт которого принимает участие в лизисе . бактериальной оболочки. В результатев бактериальной культуре Г,соб % 3 101 гес А 13 дир, содержащейплазмиду рВК 322, в течейие 16 ч прио37 С синтезируется 13555 ед. активности 3 -лактамазы (за единицу активности принято наименьшее коли-, чество фермента, которое инактивиру ет 10 М пенициллина (60 ед.) .за 1 ч при 37 С в фосфатном буфере рНо6,8-7,0). В этой же бактериальной культуре, не содержащей плаэмиду рВК 322, но подвергавшейся заражению фагом Й АрЯ 117 Кщ 54 и инкубировавшейся 2,5-3 ч при 37 С,0Заказ 287,1/23 Тираж 522 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 3а затем 14-15 ч при 28 С, синтезируется 227796 ед активности 3 -лактамазы в 1 мл культуральной жидкости. В бактериальной культуре Е.со 3 Й 3101 гес А 135 ор,. содержащей плаз миду рВК 322 и подвергавшейся заражению фагом 5 АрЯ 177 К 54, активность. 3 -лактамазы после инкубирования 2,5-3 ч при 37 С, а зао тем 14-15 ч при 28 С, достигает 2 млн. ед. в 1 мл.П р и м е р. Культуру Е,соб Ю 3101 гес А 13 ц с плазмидой рВК 322 выращивают на среде "Аминопептид", разведенной. 0,14 М раствором БаСЙ в соотношении 1:1 при 37 С на качалке до плотности 1 х 10 клеток в 1 мл. Затем эту культуру заражают фагом 11 , содержащим Ар-ген, а двЬег -мутации20 в генах Я и К, блокирующие лизис бактериальной клетки, что в свою очередь обеспечивает более длительное функционирование Ар-гена. Заражение осуществляют с множественностью 10 фаговых корпускул на 1 бактериальную клетку, Фаг полу" чают следующим образом.Лизогенную культуру, содержащую в составе своей хромосомы нужный З 0 нам фаг, в данном случаеАРЯ К 19 4выращивают при 28 С на среде "Аминопептид" на качалке до плотности клеток 1 х 108 в 1 мп. Затем этио .клетки прогревают 20 мин при 43 С, в результате чего инактивируется фаговый репрессор благодаря 1 -мутации в С 1-гене, и фаг начинает развиваться по литическому пути, через 50 мин после прогрева (теромоиндукции) при 43 С клетки лизируют, освобождая каждые 100-200 фаговых корпускул. Если плотность клеток была 1 МО мп то они обра.10 фзуют 1-2 ЧО фаговых корпускул в 1 мл.Заражение Е,сои с плазмидой, выросшей до плотности 110 ,фагом с .множественностью 10 означает, что например, к 10 мл культуры надо прилить 1 мп фаговой суспензии. После внесения фага культуру выдероживают 2,5-3 ч при 37 С, затем . культуру, зараженную фагом, инкубируют при 28 С в.течение 14 ч. Перенесение культуры с оптимальной температуры на пониженную способствует замедлению развития фага и более длительному функционированию Ар-гена. За это время в 1 мп суспензии накапливается до 2 мпн,ед активности /3 -лактамазы.