Способ отбора бактериального фага для приготовления лечебно профилактических препаратов

союз советскихСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 4327 А 1 Г 9) К 39/12, С 12 й КОМИТЕТИ ОТКРЫТИ ГОСУДАРСТВЕННЬПО ИЗОБРЕТЕНИПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРС У СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Оренбургский государственный медицинский институт и Горьковский научно-исследовательский институт эпидемиологии имикробиологии(53) 576,858.9(088.8) Изобретение относится к медицине, аименно к способам отбора бактериофагов.Целью изобретения является повышение точности и упрощение процедуры отбора фагов.П р и м е р 1. Формируют 2 пула фагов,лизоцим продуцирующих и лиэоцим не продуцирующих.Для отбора фагов продуцирующих лизоцим на строго горизонтальной поверхности в чашки Петри разливают по 10 - 15 мл 1,5- ного мясопептонного агара и затем чашки подсушивают при 37 С в течение 1-1,5 ч.Затем на поверхность 1,5 ф-ного агара наносят второй слой, состоящий из 2 мл 0,7- ного мясопептонного агара, 0,2 мл бульонной культуры индикаторной бактерии, подращенной на 2 ф-ном мясопептонном бульоне в течение 2-2,5 ч до лаг-фазы и 0,1 мл испытуемого фага, оттитрованноготак, что в 1 мл содержится 102-10 БОЕ (т.е.в верхний слой агара вйосится 10 - 10 БОЕ).После застывания верхнего слоя агара чашки инкубируют при 37 С в течение 10-12 ч, после чего на поверхность газона культуры с образованными на ней стерильными пятнами наслаивают 10 - 15 мл хлороформа на 10 мин. После того как хлороформ сливают,(54) СПОСОБ ОТБОРА БАКТЕРИАЛЬНОГО ФАГА. ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЛЕЧЕБНО- ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ (57) Изобретение относится к медицине, а именно к способам отбора бактериофагов для лечебно-профилактических препаратов, Целью изобретения является повышение точности и упрощения процедуры отбора фагов. Отбор фагов проводят иэ числа лизоцимпродуцирующих. 3 табл,чашки помещают в термостате (37 С) и учитывают лиэоцим-продукцию по образова- фнию ареолов полулиэиса вокруг бляшекчерез 1 и 12 ч (для энетробактерий) через 12и 24 ч (для стафилококков),При изучении чувствительности золотистых стафилококков к 23 бактериофагаммеждународного набора, у ряда которых обнаружена или не обнаружена продукция лизоцимподобного фермента, установлено, . Очто фаги, не продуцирующие лизоцим, имеют более узкий литический спектр по срав-0нению с лизоцимпродуцирующими фагами Ь(табл. 1. Так лизоцим-непродуцирующие Одфаги обладают почти в два раза более узким Яспектром литического действия по сравне- ъ,нию с лизоцимпродуцирующими фагами(32,37 ь лизабельных культур против 62,3соответственно). При этом сужение литиче- фского спектра фагов, не продуцирующих ли абайзоцим, в основном обусловлено ихнеспособностью вызывать лизис культур,обладающих антилизоцимной активностью(только 11,4 лизабельных культур), в товремя как лизоцимпродуцирующие фагиоказываются способными преодолевать"антилизоцимную защиту" бактерий и вызывать их лизис в 56,8 случаев.1664327 Таблица 1 Литический спектр стафилококковых бактериофагов продуцирующих и не продуцирующих лиэоцимподобные ферменты в отношении АЛА и АЛА золотистых стафилококководолжение табл.1 Из них стафилококки без нтилизоцимной активности абс.Из них филококки с антил тивностью, абс. нои а ристикаафилофагов Устойчив Л изабел Все стойчив иэабельн 5 39 88,6 ф 48 19 43,2 7,4Лизоцимнеп дуцирующие Лизоцимпро д и ющи 9,84,4164,9 ф 4,35,1 56,8 7,4 При репродукции дизентерийных фагов с различным уровнем лизоцимпродукции на изогенных штаммах шигелл Флекснера, отличающихся по уровню антилизоцимной активности происходит нарушение нор мального размножения фага, не продуцирующего лизоцимаподобного фермента, на штамме с высоким уровнем АЛА (табл. 2), что выражается в замедлении лизиса инфицированной бактерии изнутри: удлинении 10 латентного периода развития фага и периода выхода зрелых фаговых частиц; в результате чего и урожай фага к 60-й минуте инфицирования оказывается сниженным, В то время дизентерийный бактериофаг с вы соким уровнем лизоцимпродукции эффективно преодолевает антилизоцимную защиту бактерии - параметры его репродук-. ции на штаммах с высоким и низким уровнем АЛА существенно не отличаются, 20При проведении первичного отбора фагов по признаку лизоцимпродукции отбираются фаги с наиболее широким спектром действия (диапазон индекса чувствительности культур к отобранным лизоцимпродуци рующим.фагам 0,61-0,92 против 0,.18-0,92), чем достигается сокращение группы фагов для дальнейшего углублейного исследования по известному способу (от 50 до 22) соответственно. 30П р и м е р 2. Оценивают медицинскую эффективность стафилококковых фагов (на мазевой основе), один из которых продуцирует значительные количества лиэоцимоподобного фермента, а другой не проявляет способности к лизоцимпродукции, Бактериофаги применяют для санации стафилококковых бактерионосителей путем закладывания стафилофаговой мази в носовые ходы 1 раз в сутки в течение 5 - 6 дней,Иэ данных, приведенных в табл. 3, видно, что санация лизоцимпродуцирующим фагом позволяет достичь наиболее выраженного эффекта в 51,97 ь случаев по сравнению с 35,0при санации нелизоцимпродуцирующим фагом.Таким образом, отбор бактериофага по предлагаемому способу позволяет повысить эффективность создаваемых на основе бактериофагов лечебно-профилактических препаратов,Фо рмула изобретения Способ отбора бактериального фага для приготовления лечебно-профилактических препаратов, включающий выделение фага и получение фаголизата, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения и повышения точности способа, фаголизат высевают на плотную питательную среду, содержащую фагочувствительные бактерии, не проявляющие антилизоцимной активности, посевы инкубируют, обрабатывают хлороформом и отбирают фаги, образующие стерильные пятна с ареолом вторичного лизиса.1664327 Таблица 2 Параметры одиночного цикла развития лизоцимпродуцирующего и нелизоцимпродуцирующего фагов на изогенных штаммах шигеллФлекснера, отличающихся поуровню антилизоцимной активности (АЛА) Длительность латентного периода,мин.516 (8 мкг) 516-1 (2 мкг) 60 4 012 5,8 ф 0,11 101,2 .ф. 4,1 1047+ 46 20,4 20,4 9,3 9,3 516 (8 мкг) 516-1 (2 мкг) 34,827,3 29,320,7 7,6 + 0,06 10,60,08 3,1 + 0,44 2,9 ": 0,03- Р 0,05 Таблица 3 Эффективность применения лизоцимпродуцирующих и лизоцимнепродуцирующих бактериофагов для санации стафилококковых бакте- рионосителей Составитель О,ЖакетовТехред М.Моргентал актор Н.Рогули рректор М,Кучеряв аказ 2341 Тираж 458 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 инат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 10 изводственно-издательски Е 4/В (лизо- цимпродуцирующий)н Е 66/В (лизоцимнеп родуцирующий) Номер штамма шигелл Флекснера и их АЛАКонстанта скорости адсорбции фага х 10 мл/мин Х+аСредний урожай фаза на 1 клетку(к 60-й минуте инфицирования Х .щ