Способ определения степени гомологии последовательности нуклеотидов днк

СОЮЗ СОВЕТСИИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК12 Б 100 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬ ОПИСАНИЕ ИЭОБРЕ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(5 Ь) 1. Щс 1 ецз Асов ЪезеагсЬ; Б, 1978, Ч. 5, р. 2033-2037. (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ГОЮЛОГИИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ НУКЛЕОТИДОВ ДНК путем выделения и очистки препаратов ДНК из исследуемого мате риала, постановки реакции гибридиза 801 468 ции выделенной ДНК с радиактивно меченой низкомолекулярной реперной ДНК, отделения гетеродуплексов от .не- связавшейся реперной ДНК .с последующим подсчетом радиоактивности образовавшихся гетеродуплексов, о т л и" ч а ю щ и й с я тем,что, с целью ускорения и повышения воспроизводи-: мости метода; для реакции гибридизации используют высокомолекулярные фрагменты исследуемой ДНК и низкомо" лекулярные реперйой ДНК, а разделение гетеродуплексов от несвязавшейся реперной ДНК проводят с помощью электрофореза в геле при температуре, равной температуре гибридизации.Изобретение относится к молекуляр"ной биологии и может быть примененодля решения вопросов систематики раэ"личных организмов,Известен способ определения степени гомологии последовательности нуклеотидов ДНК путем выделения и очистки препаратов ДНК из исследуемогоматериала, постановки реакции гибри"дизации выделенной ДНК с радиоактивно меченой низкомолекулярной реперной ДНК, отделение гетеродуплексовот несвязавшейся реперной ДНК с последующим подсчетом радиоактивностиобразовавшихся гетеродуплексов1 ,Однако известный способ трудоемок и длителен, анализ 5-6 видовДНК занимает около месяца и не удается разделить образовавшиеся в результате реакции гомо- и гетеродуплексы радиоактивных Фрагментов, чтозатрудняет расчет степени гомологиинуклеотидных последовательност.й,Целью изобретения является ускорение и повышение воспроизводимостиметода,ЗО Цель достигается тем, что согласно способу определения степени гомологии последовательности нуклеотидов ДНК путем. выделения и очиткипрепаратов ДНК из исследуемого материала, постановки реакции гибридизации выделенной ДНК с радиоактивФно меченой низкомолекулярной репер 35ной ДНК, отделения гетеродуплексовот несвязавшейся реперной ДНК с последующим подсчетом радиоактивности образовавшихся гетеродуплексов,для реакции гибридизации используют высокомолекулярные фрагментыисследуемой ДНК и низкомолекулярныереперной ДНК, а разделение гетеродуплексов от несвязавшейся репернойДНК проводят с помощью электрофоре 45за в геле при температуре, равнойтемпературе гибридизации,Способ осуществляют следующим образом.Реакцию ДНК-ДНК гибридизации проводят в растворе, в запаяных капиллярах или ампулах, в известных условиях или заданных экспериментатором, Но в реакцию берут ДНК с разноймолекулярной массой,Исследуемые ДНК имеют большую молекулярную массу 1,более 1 млн, дальтон ), а Фрагменты меченой радиоактивной реперной ДНК дробят ультразвуком до величины 100000-200000 дальтон.Поэтому образующиеся в результате реакции гибридизации гетеродуплекСы ,исследуемых ДНК и меченых радиоак-тивных реперных фрагментов будут иметь большую молекулярную массу, чем несвязавшиеся с исследуемой ДНК меченые радиоактивные Фрагменты.,Продукты реакции гибридизации наносят в лунки на пластину агарозного геля и разгоняют в приборе для вер" тикального электрофореза в режиме, при котором гель не нагревается вы-, ше 60 ОС, т.е. выше температуры инкубации. Это предотвращает плавление образовавшихся гетеродуплексов. В качестве свидетеля при электрофорезе примейяют бромфеноловый синий, электрофоретическая подвижность ко" торого в данных условиях примерно одинакова с подвижностью несвязавшихся меченых фрагментов ДНК. После электрофореза пластину геля окрашивают 1-ным раствором бромистого этидия, анализируют в ультрафиолетовом свете и разрезают по пробам. Высокомолекулярные молекулы исследуемых ДНК и гетеродуплексы их с ме чеными Фрагментами ДНК будут находиться в верхней части геля, а не- связавшиеся меченые фрагменты ДНК- в нижней части.Нижнюю часть геля с несвяэавшимися мечеными фрагментами ДНК удаляют, а верхнюю часть геля разрезают по пробам, Пробы просчитывают на радиоактивность. Из каждого значения радиоактивности по пробам . высчитывается значение, полученное при просчете контрольный пробы, где в реак" цию гибридизации не бралась высокомолекулярная ДНК, а были только од" ни низкомолекулярные меченые фрагменты реперной ДНК. В пробе, где проводилась гибридизация высокомолекулярной реперной ДНК и низкомолекулярных меченых Фрагментов реперной ДНК, значение радиоактивности будет самым большим, Это значение и степень гомологии принимают эа 1003 и относительно ее расчитывают степень гомологии других исследуемых ДНК.П р и м е р. Ставят 7 параллельных реакций 6.штаммов стрептококков, В качестве реперного был выбран штамм Ясгер 1 ососсцв Гассецш 7379.Фрагменты ДНК этого штамма размеромтовым светом. активность.Иэ значений радиоактивности пробвычитают .значение радиоактивностиконтрольной пробы (И 7), где в реак-,цию гибридизации были взяты толькоч у 3 ниэкомолекулярные Фрагменты меченоиреперной ДНК и не было добавленовысокомолекулярных исследуемых ДНК.Значение радиоактивности пробы .М 1 получают самым высоким, так как 39в ней были гетеродуплексы, образовавшиеся в результате гибридизации высокомолекулярной ДНК реперного штамма и ниэкомолекулярных меченых Фрагментов реперного штамма. Значениестепени гомологии ДНК в пробе я 1принимают за 1004относительноее расчитывают степень гомопогии сДНК реперного штамма ДНК других исследуемых штаммов.Предложенный спосоО определениястепени гомологии нуклеотидных после.довательностей ДНК и использованием: для разделения гетеродуплексов, об 3 Ю 43 ВНИИПИ Заказ 2941/33 Тираж 521 Подписное Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 3 101. 300"400 нуклеотидов были помеченытритием (Н) и имели удельную радиоактивность 3000 имп/мкг,Эта активность недостаточно высока, поэтому соотношение взятой вреакцию меченой и немеченой ДНК было 1:1 при более высокой радиоактивности это соотношение можно увеличить до 1:100 до 1:1000),Реакция гибридизации проводиласьв 1 И стандартном солевом растворе(0,15 И - МаС 1; 0,015 И - цитрат"Иа,рН=7,0). Для этого в стеклянную микропробирку помещают 1 мкг исследуемой ДНК в объеме 20-25 мкл, в такомже количестве и объеме добавляютученые фрагменты реперной ДНК. Иикропробирку герметически закрываютили запайвают и помещают на 510 мин в кипящую водяную баню для денатурации ДНК. Затем микропробиркус реакционной смесью помещают в термостат с температурой 60 ОС для инкубации в течение 18-2 М ц.По истечении времени инкубациипробирку вскрывают к пробе добавляют5 мкл 204-ного раствора сахароэыс 13-ным бромфеноловым синим. Пробы наносят в лунки на пластине 8-123ПААГ.геля (попиаккриламидного геля)в приборе для вертикального электроФореза, Гель можно формировать какна пластинах так и в трубках, аэлектрофореэ на пластинах можно про"водить как в приборе для вертикаль,ного, так и в приборе для горизонтального электрофореэа, ЭлектроФореэ проводят в тецение 1-2 ц в трисборатном буФере рН 8,0 следующегосостава: трис-НС 1 - 0,09 И; НЭВОЗ 0,09 И ЭДТА - 0,0025 И. Напряжениеи силу тока подбирают с таким расчетом, чтобы пластина не нагреваласьдо 60 ОС, для предотвращения плавления образовавшихся при реакции гиб"ридиэации гетеродуплексов.Верхнюю камеру прибора подключают к отрицательному электроду, анижнюю - к положительному, Так какмолекулы ДНК имеют суммарный отрицательный заряд, они будут перемещаться вслед за Фронтом свидетеля,к положительному электроду - в нижнюю часть геля. Бромфеноловый синий,выступающий в качестве свидетеля,имеет в данных условиях электрофоретическую подвижность равную подвижности молекул ДНК размером 300400 нуклеотидов. Электрофорез прекращают при достижении свидетелемнижней границы геля. Гель окрашивают 1-:-ным раствором бромистого этидия в течение 10"20 мин и ана"лизируют при освещении ультрафиолеНижнюю часть геля, содержащую отогнанные несвяэавшиеся с исследуе мойДНК Фрагменты меченой репернойДНК, удаляют,Верхнюю часть геля, содержащую образовавшиеся в результате реакциигибридизации гетеродуплексы исследуеюх и реперной ДНК, разрезают по пробам. Пробы просчитывают на радио разовавшихся в результате реакции гибридизации, и несвязавшихся радиоактивных Фрагме.гов реперной ДНК эпектрофореза в 0,8-1-ном агарозном пластинчатом геле является менее трудоемким, легко воспроизводимым, позволяет в 2-3 раза ускорить полу" чение результатов по сравнению с известными. На исследование ДНК 6 штаммов стрептококков было затрачено 2недели, по сравнению с известным 5-6недель.