Ферментный электрод, амперометрически реагирующий на присутствие субстрата соответствующего фермента в анализируемом образце

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 19 5 С 12 0 1/ ОБРЕТЕН ИСА ТЕНТУ ОВ)д Майкл КристоСтирлин 6 -ПЕРО- ПРИОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССРГОСПАТЕНТ СССР)(71) Кембридж Лайф Саенсиз ПЛС ((72) Хью Петер Веннетто, ДжерарДелани, Джереми Ричард Мейсон,фер Фрэнк Терстон, Джон Лейнги Дэвид Роберт Де Кейзер (ОВ)(54) ФЕРМЕНТНЫЙ ЭЛЕКТРОД, АММЕТРИЧЕСКИ РЕАГИРУЮЩИЙ НА Изобретение относится к ферментным электродам, состоящим из фермента, обездвиженного на электропроводной подложке, и реагирующим амперометрически на каталитическую активность фермента в присутствии соответствующего ему субстрата. В особенности, но не исключительно, настоящее изобретение относится к электродам, которые могут использоваться для детектирования уровней глюкозы как 1 п ттго, так ии ччо и которые содержат электропроводную подложку, на которой иммобилизована оксидоредуктаза, например, глюкозооксидаза, причем электрод амперометрически реагирует на каталитическую активность иммобилизованного фермента, когда он введен в глюкозосодержащий образец,СУТСТВИЕ СУБСТРАТА СООТВЕТСТВУЮ- ЩЕГО ФЕРМЕНТА В АНАЛИЗИРУЕМОМ ОБРАЗЦЕ(57) Использование; биохимия, клиническая биохимия, техническая микробиология. Сущность изобретения: ферментный электрод, состоящий из фермента (оксидазы, обычно гл юкозооксидазы), иммобилизованного на поверхности палладизированного или платинизированного угольного или графитивого слоя, обладает способностью амперометрически реагировать на присутствие субстрата данного фермента в жидком образце, контактирующем с электродом, Электрод демонстрирует линейность в широком диапазоне концентраций, хорошую скорость ответа и высокую операционную стабильность также, как и стабильность при хранении. 3 з,п. ф-лы, 19 ил,Цель - повышение экспхарактеристик электрода,В соответствии с настоящим изобретением в ферментном электроде используется новая угольная подложка, позволяющая закреплять фермент, например глюкозооксидазу, на электроде более эффективно, что делает конструкцию амперометрического датчика намного более быстродействующей и стабильной, В этом усовершенствовании ферментном электроде нет необходимости использовать посреднический реагент (хотя, при желании, его можно ввести) и как было установлено, он работает в присутствии очень малых уровней растворенного кислорода, Он дает большие выходные сигналы, например, плотности тока, равные сотням микроампер на квадратный санти(диаметром 1,5 мм), Игла может быть вставлена через резиновое уплотнение в сосуд (который может входить, например, в состав ферментера или аналогичного устройства или в резервуар для отходов) и использована в качестве зонда-датчика для измерения концентрации глюкозы раствора, содержащегося в сосуде, В этой конфигурации чувствительный электрод защищен окружающей иглой в момент ввода, но может также быть вытолкнут наружу из иглы, если необходимо, после стадии ввода.Хотя вышеописанные миниатюрные зонды дают сигналы, которые как правило лежат в пределах от 1 до 10 мкА, соответствующие приборы позволяют производить измерения в диапазоне от 1 до 100 нА. Поскольку токи сигнала в этом диапазоне поддерживаются ферментными электродами (в соответствии с настоящим изобретением) очень малого размера (площадь приблизи 40 45 50 55 ляют около 2,5 овсего сигнала при уровнеглюкозы 5 ммоль/л,Применение электрода в различныхконфигурациях аналитического биодатчика.Успешное применение ферментного 5электрода в соответствии с настоящим изобретением в ячейке типа "Ранк" в которойиспользуется электрод Кларка, описанныйвыше, демонстрируется результатами, рассматриваемыми выше, Продемонстрировано, что электрод дает очень хорошиерезультаты при использовании его в другихрежимах датчика, например, в качестве зонда,Например, изготовлен зонд диаметром 152 мм широко распространного типа, используемого во многих обычных электродах. Вэтом зонде электрод установлен на проволоке и запечатан в стеклянной трубке, Егоможно поместить (с прикрепленными алектродом сравнения и контрэлектродом) в перемешиваемые пробные растворы,содержащиеся в химическом стакане иликаком-либо другом сосуде, чтобы произвести надежные измерения концентрации 25глюкозы без необходимости удаления атмосферного кислорода, Из измерений припомощи этого зонда и зондом меньших размеров аналогичной конструкции установлено, что токовый ответ электродов в растворе30с фиксированной концентрацией глюкозыприблизительно пропорционален кажущейся площади или весу электрода,Изготовлены также зонды, в которыхэлектрод сделан миниатюрным (площадью 35приблизительно от 0,25 до 0,50 мм, весомот 30 до 60 мкг). Проволочная основа покрыта пластмассовой оболочкой, и зонд с оболочкой поместили в катетерную иглу тельно 0,005 мм и весом 1 мкг), такие электроды могут быть расположены в тонкихигольчатых микрозондах, подобных таким,которые могут найти применение в катетерных зондах для измерений гп аппо.Чтобы продемонстрировать применимость других полимеров в качестве связующих в ферментных электродах в соответствиис настоящим изобретением и других металлов платиновой группы, созданы электродыиз глюкозооксидазы с использованием поливинилацетата в качестве связующего ипалладия в качестве металла платиновойгруппы,В первом случае изготовлен электрод изглюкозооксидазы путем иммобилизацииглюкозооксидазы методом А, описаннымранее, на поверхности электрода из платинированной угольной бумаги, имеющегопрактически конструкцию, описанную ранее (пример 2), но с использованием 50 весовых процентов поливинилацетата вкачестве связующего вместо политетрафторэтилена,При испытаниях с использованием тойже системы электродов "Рэнк" при 325 мВполучен практически линейный ответ, какпоказано на фиг, 1.3.Во втором случае изготовлен электродиз глюкозооксидазы путем иммобилизацииглюкозооксидазы методом А, описаннымвыше, на поверхности электрода на палладированной угольной бумаге, изготовленного путем осаждения коллоидальногопалладия на поверхности угольного порошка (номинальный размер частиц 30 нм; .Чц сап ХС) с последующим связываниемпалладированного угольного порошка в виде тонкого слоя (0,1 мм) на поверхностиэлектропроводной угольной бумаги с использованием в качестве связующего 50 весовых процентов от веса палладированногоугольного порошка политетрафторэтилена.Диск диаметром 2 мм, вырезанный изобработанной палладированной угольнойбумаги, укреплен на платиновом контактедвухэлектродной ячейки, описанной на фиг,16 и испытан на ответ на глюкозу при 325мВ, Результаты представлены на фиг, 14,они снова показывают практически линейный ответ - характеристику зависимостиплотности тока от концентрации глюкозы. Ввиду очевидной эквивалентности платины, палладия, рутения и родия и других металлов платиновой группы в электродах газовой диффузии, следует ожидать, что и другие металлы платиновой группы, например, рутений и родий, эффективны в качестве альтернатив платине и палладию вферментных электродах в соответствии с настоящим изобретением,П р и м е р 4 (сравнительный). Элктрод согласно изобретению получают практически в соответствии с опиСанием в примере 2 за исключением того, что глюкозооксидазу наносят (иммобилизукг) на матрице простой абсорбцией из 5-го водного раствора глюкозооксидазы без последующей сшивки. В качестве субстрата используют коммерчески доступную смолу на платинизированной углеродистой бумаге (Рготосесп), содержащей частицы тонко измельченного преплатинированного порошка углерода (номинальный размер 30 нм, Чосап ХС, 10 вес, адсорбированной коллоидной Р 1, связанного 50 по весу политетрафторэтиленом, с полным содержанием Р 1 5 вес, на поверхности подложки электропроводящей углеродистой бумаги Тогау). Квадратный сантиметр материала Рго 1 отесп погружают в этанол на ч (это необходимо для обеспечения смачивания и пропитки раствором глюкозооксидазы), трижды промывают фосфатным буфером, сушат промокая, и погружают в раствор водного фосфатного буфера. содержащий 5 вес. глюкозооксидазы. на 90 мин, Затем пропитанный материал электрода промывают свежим раствором фосфатного буфера,Электрод Матсушита получают согласно известному способу,Графитовый порошок (ВДН) и порошок оксида рутения (А бпсп) вначале смешивают вручную в соотношении 95графита, 5Вв Ог с последующим трехчасовым перемешиванием ролика во вращающейся трубке.200 мг смешанного порошка помещают затем в 13 мм (диаметр) пресс-форму в КВг пресс, откачивают в течение 3 мин и прессуют в течение 3 мин под давлением 11 т,Затем спрессованный диск пропитывают раствором глюкозооксидазы описанным ранее способом, опуская начальная обработку электрода этанолом, в которой нет необходимости при использовании гидрофобного связующего,Тестовая процедура.Характеристики обоих твердофазных глюкозооксидазных электродов сравнивают на двухэлектродной ячейке, изображенной на фиг. 16, используя пористую (0,05 мкм) поликарбонатную (Мысероге) мембрану для содержания диска ферментного электрода в контакте с рабочим электродом, Измерение проводят, используя потенциометр Тйопзоп Мпэта 1 при 340 м Вольт, против сравнительного счетчика электрода хлористого серебра, В обоих случаях тест проводят, используя диски диаметром 1,5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 мм, вырезанные из материала электрода, пропитанного глюкозооксидазой, полученного описанным выше способом,Результаты,Чувствительности двух электродов к повышению концентрации глюкозы представлены на фиг. 17. Для обоих электродов отношение сигнал/шум составляет 3 нА, обеспечивая при 25 мкМ глюкозы отношение сигнал/шум 5:1 для электрода согласно изобретению по сравнению с отношением 3:1 для известного электрода. На фиг. 17 показаны также существенно более высокие уровни ответа при концентрациях глюкозы вплоть до 50 мкМ и линейность вплоть до 50 мкМ,Стабильность,На фиг, 18 и 19 представлен выход тока для каждого электрода в течение 24 ч после пропитки глюкозооксидазой и спустя 10 и 79 дней (материал электродов хранили влажным в фосфатном буфере при комнатной температуре).Оба электрода демонстрируют одинаковые отклонения при хранении,Однако что более существенно, электрод Матсушита демонстрирует линейность ответа только при концентрациях глюкооксидазы в интервале 0 - 5 ммол/л. Электрод согласно изобретению демонстрирует практически линейный ответ в интервале 0-25 ммол/л. но с гораздо более высокими уровнями ответа, и линейностью, которые не меняются со временем. чем отличается электрод Матсушита.Время ответа,Электрод согласно изобретению демонстрирует почти мгновенный ответ на добавление глюкозы, причем пик появляется примерно через 30 с, Для сравнения электрод Матсушита демонстрирует лишь весьма вялый ответ, причем пик ответа появляется только спустя примерно 2,5 мин.Формула изобретения 1, Ферментный электрод, амперометрически реагирующий на присутствие субстрата соответствующего фермента в анализируемом образце. состоящий из электропроводящей подложки с иммобилизованным на поверхности ферментом класса оксидоредуктаз, и ричем электропроводящая подложка сформирована в виде электропроводящего пористого слоя частиц графита или углерода с равномерно распределенным по объему металлом. о тлича ющийся тем,что, сцельюповышения эксплуатационных характеристик электрода, используют металлы платиновой группы коллоидного размера. предварительно адсорбированные или предварительно осажденные на поверхности2 индивидуальных частиц углерода или графита перед формированием электропроводящей подложки, а для формирования электропроводя щей подложки используют полимерное связующее. 2, Электродпоп,1, отличающийся тем, что металл платиновой группы представляет собой платину или палладий. 3, Электродпоп,1, отличающийсятем, что в качестве полимерного связующего используют фторуглеродистый полимерили поливинилацетат,4. Электрод по и, 1, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что электропроводящая подложка со 5 стоит из электропроводя щей углеродной бумаги или электропроводящей углероднойткани, соответственно покрытой или импрегнироваан ной пористым слоем полимерсвязанных частиц углерода или графита,10 имеющим мелкодисперсные частицы адсорбированного или осажденного предварительно металла платиновой группы.. ббеден оаЫугфФ Ю 75 Ю Я .7 Р Юржя, юон Югер 1 у 1 птйипеяьноппь еюакююео ббеденоргон югоноуногоюродаЗР/ЮР гю.жю Фа,1 Л фйЮЮ "бд,Ж 0 1801119 Опп 5 альноопь едюмпзнпеп змектрода, хрпнящегпся Юп Юаяюпм Заде лрикомнатной темпера. туре- атдет нп Хмм еяюкозы8 И 1 БО ь 5 ИФЯ 800- ах 8 етный электраФ УЯ электрод саелосно ажФвтвфюм4 б Ю Ю УР Ф 16 Ю Ю Концентрация глюкозы, эмальлФиг. Ю%5 злектрод соглагноиЯЮ юЮР Ю Е 4 б Ю 10 УГ 14 1 бд Юб Лонцентроция жюле. ммоль/л ОиеУ11 1 лотноппь токХ Ю УХ онцентрация галаююл, ммольlл(ЪеЮРО Юг ЮХ бг Хтцентраи,ия лиловата ммалылРие.У1801119 Ьощнпсаь ткауды гш т гю л ю л Бпнцентрацая лакаозы. ммольл47 аг./г5 Л 7 Х го,ур 1 пнцРнтрацоя глюкозо. ммаль 1 л лунга405 Ю 75 Ю Ю 4 Ю пнценщрпцоя глюкозы, ммолылЬг 14метр (кажущейся площади электрода) в растворе глюкозы 10 мМ, Это, очевидно, намного больше, чем в любом другом ранее известном амперометрическом ферментном биодатчике, и может эффективно использоваться для изготовления микропробных биоратчиков с площадью электрода менее 1 мм, дающих ток от 0 до 100 наноампер, Электрод можно изготовить, используя очень малые количества иммобилизованного фермента, Он реагирует йа глюкозу значительно быстрее, чем известный глюкозный датчик, как правило в течение 1 - 2 с при отсутствии защитной мембраны и в течение 10 - 30 с с мембраной. Он обладает очень хорошей стабильностью при хранении во влажном состоянии даже при комнатной температуре; электроды дают хороший выходной сигнал даже спустя несколько месяцев, Они имеют расширенный рабочий диапазон, нуждаются в значительно более низком рабочем потенциале, чем нормальный рабочий потенциал (325 мВ по сравнению с более распространенным потенциалом 650 мВ) и имеют очень низкий фон при рабочем потенциале,Основой настоящего изобретения является ферментный электрод или биодатчик, содержащий фермент, иммобилизованный на поверхности электропроводной подложки, состоящей или включающей пористый слой угольных или графитных частиц, связанных смолой, Эти частицы тщательно перемешаны с тонко измельченным металлом платиновой группы, либо осаждены или адсорбираваны на поверхности отдельных частиц перед связыванием их с образованием указанного слоя, в результате получается пористый слой подложки, в который указанный фермент адсорбируется или иммобилизуется и который образует существенно гетерогенный слой угольных или графитовых частиц, связанных смолой, с диспергированным практически равномерно по всему слою металлом платиновой группы. Таким образом, специфическое отличие электрода в соответствии с настоящим изобретением заключается в том, что электрод представляет собой практичеки гетерогенный слой угольных или графитовых частиц, связанных смолой, в котором по существу равномерно по всему слою диспергирован металл платиновой группы, Слой угольного порошка со смолой в качестве связующего рекомендуется изготовлять из частиц угольного порошка, связанных смолой, на которые перед формовкой подложки осаждают или адсорбируют коллоидальные платину или палладий, В качестве связующих смол при формовке электродной подложки, ис 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 пользуемой в настоящем изобретении, из платинированных угольных частиц рекомендуется использовать фторуглеродистые смолы, особенно политетрафторэтилен.Рассмотрим конструкцию ферментного электрода в соответствии с настоящим изобретением более подробно, Как указывалось, предпочтительный вариант электрода содержит слой угольного порошка, связанного смолой, в котором на поверхности частиц порошка перед связыван.ием их адсорбирован металл платиновой группы, например, платина или палладий.В качестве угольного порошка может использоваться любой угольный или графитовый порошок, который легко допускает последующую иммобилизацию фермента, а для этого необходимо использовать угольные порошки, имеющие большую плотность функциональных групп, например карбоксильные, аминные или серосодержащие группы, на поверхности, в отличие от более стекловидных углей, которые плохо связывают ферменты. Размер частиц может лежать в пределах от 3 до 50 нм, обычно от 5 до 30 нм.Платина (или палладий) может быть нанесен на угольные частицы любым известным способом, например осаждением парообразной фазы, электрохимическим осаждением или простой адсорбцией из коллоидной суспензии (что предпочтительнее), чтобы нагрузка металлом платиновой группы составила от 1 до 20 мас. угля, желательно от 5 до 15 мас.ф Однако эти пределы указаны скорее из практических соображений, чем из теоретических, При количестве металла платиновой группы менее 1выходной сигнал падает до уровня, который на практике слишком низок и не поддается измерению, если не пользоваться очень чувствительным прибором, При количестве более 20 мас.нагрузка металлом платиновой группы становится неэкономичной при малом увеличении эффекта - уменьшении времени срабатывания, повышении чувствительности и т,д,В действительности же при очень больших нагрузках металлом чувствительность начинает падать. В предпочтительной технологии угольный порошок платинируют или палладируют окислительным осаждением соединения платины или палладия, таким как платинохлористоводородная кислота, или, что еще желательней, комплексом платины или палладия с окисляемым лигандом в присутствии угольного порошка, с целью осаждения платины или палладия коллоидных размеров непосредственно на поверхность угольных частиц,ю тхГлюк аида ммапьlлОыг Ютавитель И.Пред М,Моргент риваал Редактор ктор М.Максимишинец Заказ 1185 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарин5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 После платинирования или палладирования платинированный или палладированный угольный порошок формуют с применением соответствующей водоотталкивающей связующей смолы, желательно фторуглеродной смолы, такой как политетрафторэтилен, для получения либо полностью самонесущей пористой формованной структуры, содержащей в основном указанные связанные смолой платинированные или палладированные частицы угольного порошка, либо, в более распространенном варианте, пористый формованный поверхностный слой таких связанных смолой частиц, закрепленный на электропроводной подложке, например, металлической, угольной или графитовой. Особенно рекомендуемым материалом подложки для формированного связанного смолой платинированного уголь- ното слоя является угольная бумага или угольная ткань с открытыми порами, Чтобы сохранить максимальную пористость, количество смолы, используемой в качестве связующего агента, должно быть минимально необходимым для обеспечения механической целостности и стабильности слоя электрода, который обычно имеет толщину не более примерно 0,1 - 0,5 мм, хотя возможно и дольше, С точки зрения требований структурной целостности, механической прочности и пористости количества связующей смолы некритичны и могут лежать в пределах начиная с таких малых количеств, как 5 или 10 мас.;6 от количества платинируемого или палладируемого порошка угля, и достигая 80 мас,/, но обычно ее количество лежит в пределах от 30 до 70 мас./ Могут использоваться различные смолы, включая смолы, являющиеся электропроводными или полупроводниковыми. но рекомендуется применять синтетические фторуглеродные смолы, особенно политетрафторэтилен, Ввиду небольшой, но важной потребности в кислороде для окислительного процесса необходимо, чтобы связующее было проницаемым для кислорода. Для этого связующее должно обладать минимальной растворимостью по отношению к кислороду при атмосферном давлении в количестве не менее-з з2 х 10 см 02 (измеренного при стандартных температуре и давлении) на 1 см полимера.Рекомендуемые подложки ферментных электродов, используемые в соответствии с настоящим изобретением, фактически представляют собой имеющиеся на рынке материалы, продаваемые под торговой маркой Ргососесп компанией "Прототек", Ньютон-Хайлендс, шт. Массачусетс, и до настоящего времени используемые в качестве электодов электрокаталитической газовой диффузии в топливных баках, В общих чертах, коллоидная платина с размером частиц в диапазоне от 15 до 25 А (1,5 - 2,5 нм) абсорбируется на поверхности угольного порошка (размеры частиц от 50 до 300 А - 5 - 30 нм) путем образования коллоидного раствора платины и зтц в присутствии угольного порошка, который играет роль зародышеобразующего агента для коллоидного раствора. Платинированные частицы угля затем формуют в электропроводную поддерживающую структуру, например лист угольной бумаги, при помощи синтетической связующей смолы, желательно фторированного углеводородного полимера, и особенно политетрафторэтилена (П ФТЭ),В другом варианте платинированные частицы угля впитываются в предварительно изготовленную пористую угольную тканьи связываются в ней при помощи фторуглеродной смолы, желательно политетрафторэтилена. Следует, однако, иметь в виду, что настоящее изобретение не ограничивается применением материалов Прототек, но охватывает и другие аналогичные материалы подложки, содержащие связанный смолой и сформованный платинированный или палладированный угольный порошок,Иммобилизация фермента на поверхности, связанной смолой, платинированной или палладированной угольной подложки, может быть осуществлена множеством хорошо отработанных приемов, например, ковалентным связыванием с карбодиимидомили карбонилдимидазолом в качестве реагента, ковалентным связыванием с 1,6-динитро,4-дифторбензолом (ДНДФБ) или образованием перекрестных связей с глютаралдегидом,Типичными примерами протоколов иммобилизации фермента, глюкозооксидазы, могут служить следующие.А, Обработка карбодиимидом1. Нарезать куски электрода соответствующих размеров из листа электродного материала П рототек.2. Погрузить электроды в этанол на время около 5 мин, чтобы обеспечить полное намокание связующего и подложки с покрытием из ПТФЭ.3. Удалить электроды из этанола и промыть их тщательно дистиллированной водой для удаления следов этанола4, Приготовить 5 мл (или менее) раствора 0,15 М 1-циклогексил-(2-морфолино)карбодиимид р-метилтолуолсульфоната в 0,1 М ацетатного буфера с рН 4,5 и поместить в него электроды на 90 мин при комнатной температуре, Может быть использованослабое перемешивание при помощи механического вибратора. Если электроды плавают по поверхности раствора, значит они недостаточно смочены и следует повторитьобработку, начиная с операции 2.5, Вынуть электроды и тщательно промыть их дистиллированной водой. Положить их в свежеприготовленный раствор глюкозооксидазы (5,0 мг/мл) в ацетатном буфере с рН 5,6 на 90 мин при комнатнойтемпературе со слабым механическим потряхиванием.6. Вынуть электроды из раствора фермента и тщательно прополоскать их 0,1 М ацетатного буфера. Теперь электроды готовы для использования,7. Хранить электроды при 4 С в 0,1 Мацетатного буфера с рН 5,6, В. Обработка карбонилдимидазолом1, Выполнить вышеописанную операцию 1 и пропустить операции 2 и 3.2. Приготовить раствор К,й -карбонил 1диимидазол в безводном диметилформамиде (40 мг/мл),3, Поместить электроды в этот растворна 90 мин при комнатной температуре прилегком встряхивании, если потребуется.4, Вынуть электроды из раствора и отсушить избыток раствора карбонилдимидазола,после чего поместить их в свежеприготовленный раствор глюкооксидазы еще на 90 мин.5. Выполнить вышеописанные операцииби 7.С, Обработка динитродифторбензолом1, Выполнить операции 1 - 3 в примере А, 2. Тщательно промыть электроды в буфере из бората натрия (0,1 М, рН 8,5).3. Приготовить раствор 1,6-динитро,4- дифторбензола в метаноле (0,1021 г/5 мл) ипоместить в него электроды на 10 мин прикомнатной температуре.4. Вынуть электроды и тщательно ихпромывать буфером из бората, после чегопоместить их в раствор глюкозооксидазыеще на 90 минут при комнатной температуре,5, Выполнить операции 6 и 7 примера А.Для процесса иммобилизации могут использоваться и аппараты других типов,включая бифункциональные агенты с переменной длиной цепи, например, диимидаты, такие как диметилмалонимидат илидиметилсуберимидат.В другом варианте было установлено,что простая адсорбция фермента на подложке из платинированного или палладированного угольного порошка с полимернымсвязующим, т.е, без поперечных связей, эффективна для некоторых ферментов и в особенности для глюкозооксидазы.5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Обычно, хотя и необязательно, поверхностный слой обездвиженного фермента будет физически защищен нанесением соответствующей пористой, например поликарбонатной, пленки или мембраны, которая естественно, должна быть проницаемой для ферментного субстрата (клюкозы), который должен быть определен, Некоторый недостаток таких мембран состоит в том, что они увеличивают время реакции датчика, но даже такая мембрана не дает датчикам времени реакции, которые сравнимы, а во многих случаях и значительно меньше времени реакции обычных ферментных электродов.Настоящее изобретение относится в особенности к электродам из глюкозооксидазы, т.е, к таким электродам, в которых иммобилизованным ферментом является глюкозооксидаза, но очевидно, что могут использоваться и другие оксидоредуктазы, хотя и не всегда с эквивалентным эффектом, Это необязательно объясняется собственной неэффективностью фермента, а возможно влияние и других факторов. Например, при определении щавелевой кислоты при помощи оксалатоксидазы сама щавелевая кислота претерпевает электро- механическое окисление на электроде основания, тем самым в значительной степени маскируя любое воздействие со стороны фермента, Однако к другим подходящим оксидоредуктазам относятся лактатоксидаза, галактозооксидаза, холестеролоксидаза и другие перекисьобразующие ферменты, а также комбинации иммобилизованных ферментов, включая комбинации неоксидазы и оксидазы, первая из которых воздействует на окисляемый продукт с созданием поддающегося измерению тока, пропорционального концентрации образца.Одна такая комбинация представляет собой комбинацию бетагалактозидазы и глюкозооксидазы (для количественного определения лактозы) или комбинацию бетаглюканового деполимеризующего фермента, бета-гл юкозидазу и гл ю козооксидазу (для определения бетаглюканов).К другим типам использования датчиков относится использование ферментных или неферментных реагентов или процессов, взаимодействующих с первичным субстратом, который нас интересует, в предшествующей реакции, с получающийся продукт включает вещество, которое играет роль субстрата для ферментного электрода в соответствии с настоящим изобретением, В области иммунохимических реакций имеется множество примеров таких предшествующих операций и специалисты в данной области знают способы использования таких реакций при построении датчиков,включая иммунодатчики, в которых используются ферментные электроды в соответствии с настоящим изобретением.Однако главное использование электродов в соответствии с настоящим изобретением - это биодатчики для определения и(или) количественного измерения окисляемого субстрата, особенно глюкозы, впробе,особенно в клинической пробе, например, 10крови, сыворотки, плазмы, мочи, пота, слези слюны,К другим возможным неклиническимприменениям относятся:а) контроль ферментации 15Ь) управление производственными процессами,с) контроль окружающей среды, например, слежение за стоками и загрязнениямижидкостями и газами, 20о) контроль пищевых продуктов,е) ветеринараные применения, особенно применения, аналогичные приведеннымвыше клиническим применениям,Биодатчики и другие датчики, имеющие 25ферментн ы й зле ктродн ый материал в соответствии с настоящим изобретением, могутвключать и другие конструктивные элементы, электрические провода, неэлектропроводные (изоляционные) основы или зонды и 30т.п., такие элементы в конструкции являются распространенными и не нуждаются вподробном описании, Достаточно лишь отметить, что в тех случаях, что обычно и бывает, когда материал электрода представляет 35собой тонкий бумажный лист или пластину,биодатчик обычно включает изоляционныйподдерживающий элемент или зонд, на котором установлен материал электрода, припомощи которого материал электрода может быть введен в пробу, В таких случаяхфактические размеры куска материала электрода могут быть очень небольшими - неболее нескольких квадратных миллиметрови даже меньше. Электрический контакт с 45материалом электрода может быть созданпо-разному, например путем установки материала электрода с поверхностным контактом с электропроводным контактом иликлеммой, например из платинового, серебряного или другого подходящего проводника.Когда материал электрода имеет толщину ипрочность, достаточные для того, чтобы онбыл полностью самонесущим, можно обойтись без изолирующих опор или носителей 55для материала электрода, и электрическиепровода соединяются непосредственно к поверхности материала электрода.Кроме угольной бумаги могут использоваться и другие поддерживающие элементы, такие как электрически полупроводящаяповерхность, например, поверхность из полевого транзистора, или,электрически непроводящая поверхность. В последнемслучае электрический контакт может бытьсоздан непосредственно с металлом платиновой группы угольного или графитовогослоя с полимерным связующим,Приготовление материалов ферментных электродов в соответствии с настоящимизобретением и их свойства иллюстрируются в следующих примерах,П р и м е р 1 (для сравнения). Ферментный электрод изготавливают в соответствии с известным уровнем техники путемэлектрического осаждения тонкого слоя (менее 1 мкм) платины на поверхности электропроводного основания, представляющегособой пористую угольную бумагу с полимерным связующим, содержащую электопроводные угольные черные гранулы (ЧцсапХС), имеющие номинальные размеры частиц, равные 50 нм и вплавленные на листвыпускаемой на рынок графитизированнойугольной бумаги с использованием в качестве связующего 10 мас.политетрафторэтилена.На поверхности различных проб платинированной угольной бумаги иммобилизуют глюкозооксидазу из АэрегдПоз пдегпутем обработки карбодиимидом, описанной выше. и путем создания поперечныхсвязей с глютаральдегидом обработкой платинированной поверхности электрода воднымраствором глюкозооксидазы, высушиваниеми последующим созданием поперечных связей осажденного фермента посредствомвыдерживания глютаральдегида при 25 С.Для последующих испытаний материалэлектрода нарезают на диски диаметром 2мм,П р и м е р 2, Глюкозный электрод.Глюкозооксидазу из Азрегд 1 цз пдегиммобилизуют на платинированной угольной бумаге. подаваемой под торговым знаком "Рго 1 отесп" компанией "Прототек", шт,Массачусетс, США. и содержащей частицыплатинированного угольного порошка(Чысап ХС, размер частиц платины от 1,5до 2.5 нм, размер частиц угля 30 нм, нагрузка платиной готового продукта составляет0,24 мг см при помощи вышеописанных-2обработок. а именно: обработкой карбодиимидом, обработкой карбонилдиимидазоломи обработкой динитродифторбензолом.В отдельных экспериментах глюкозооксидазу иммобилизуют на материале Прототек созданием поперечных связей сглютарельдегидом и простой абсорбцией,т.е, без создания поперечных связей, с вы 1801119 1210 15 20 25 30 35 40 45 50 55 держиванием материала Прототек в свеже- приготовленном растворе глюкозооксидазе (5 мг мл ") в ацетатном буфере с рН 5,6 в течение 90 мин при комнатной температуре, В другом варианте удобно осуществлять адсорбцию фермента при помощи процесса электрофореза, для чего материал основы электрода выдерживают при положительном потенциале в растворе фермента в течение 60 мин,П р и м е р 3, Используя вышеописанную обработку карбодиимидом, иммобилизуют следующие ферменты на платинированной угольной бумаге из Прототека, а именно на угольной бумаге с политетрафторэтиленом в качестве связующего, полученной из предварительно платинированного угольного порошка:лактатоксидазагала ктиозоксидазагл юкозооксидаза/бета-гала ктоксидаза, Чтобы дополнительно проиллюстрировать преимущества настоящего изобретения и свойства материалов ферментных электродов в соответствии с настоящим изобретением по сравнению с известными электродами, материалы ферментных электродов, приготовленные как в вышеприведенных примерах, испытывают на амперометрическую реакцию в ячейке, содержащей модифицированную систему кислородных электродов Ранк (фирма "Ранк бразерс", Боттишем, Кембридж), изобра- женную на прилагаемых чертежах, В этой системе мембрану заменяют ферментным электродом на угольной бумаге (диаметром 5 мм) в соответствии с настоящим изобретением, который удерживаетсяна платиновом капельном электроде, Противоположный электрод (платиновая фольга) помещают через крышку ячейки. Эталон - электрод серебро-хлористое серебро, В некоторых испытаниях(с защитной мембраной и неперемешиваемыми растворами) используют двухэлектродную конфи гура цию, и ротивоположный электрод сравнения представляет собой окружающее кольцо из хлорида серебра, Обычно испытуемые растворы в буфере с рН 7 перемешивают магнитным полем, а рабочий электрод держат при потен циале 600 м В относительно опорного потенциала при помощи потенциометра, При использовании двухэлектродной конфигурации используют потенциал 325 мВ. После истечения времени, достаточного для того, чтобы фоновый ток упал до низкого уровня, шприцем вводят раствор субстрата, Токовый ответ регистрируют самописцем,На фиг, 1 изображен ответ электрода из глюкозооксидазы в соответствии с настоящим изобретением в сравнении с глюкозооксидазой, обездвиженной на угольных электродах других типов; на фиг. 2 - первая кривая стабильности электрода из глюкозооксидазы; на фиг, 3 - вторая кривая ответа электрода из глюкозооксидазы при разных концентрациях глюкозы; на фиг, 4 - кривая ответа электрода из глюкозооксидазы в условиях изменяющегося давления кислорода среды; на фиг. 5 - график влияния на характеристики электрода из глюкозооксидазы времени его хранения при комнатной температуре, на фиг. 6 - сравнительный график влияния на характеристики электрода известного уровня техники его хранения при комнатной температуре; на фиг. 7 - сравнение между ответом электрода из глюкозооксидазы, иммобилизованной глютарал ьдегидом в соответствии с настоящим изобретением, и ответом электрода из глюкозооксидазы, иммобилизованной глютаральдегидом в соответствии с известным уровнем техники; на фиг, 8 - то же, но для иммобилизации используют карбодиимид; на фиг, 9 - сравнение между ответом электрода из лактатоксидазы, иммобилизованной карбодиимидом в соответствии с настоящим изобретением, и ответом электрода из лактатоксидазы, иммобилизованной карбодиимидом в соответствии с известным уровнем техники, на фиг, 10 и 11 - соответственно кривые ответа электродов из галактозоксидазы и лактатоксидазы в соответствии с настоящим изобретением; на фиг, 12 - кривая ответа комбинированного электрода из глюкозооксидазы и бета-галактозидазы в соответствии . с настоящим изобретением; на фиг, 13 - кривая ответа электрода из глюкозооксидазы в соответствии с настоящим изобретением, в котором используется в качестве связующего для платини рован ного угол ь ного порош ка поливинилацетат вместо политетрафторэтилена; на фиг, 14 - кривая ответа электрода из глюкозооксидазы в соответствии с настоящим изобретением, в котором глюкозооксидаза обездвижена на электроде из угольной бумаги, содержащем поверхностный слой палладированного угольного порошка, связующим (политетрафторэтиленом); на фиг. 15 - модифицированная электрохимическая ячейка фирмы "Рэнк", используемая для определения рабочих характеристик электродов в соответствии с настоящим изобретением; на фиг, 16 - двухэлектродная конфигурация, используемая для некоторыхизмерений; на фиг, 17 - чувствительность двух электродов к повышению концентрации глюкозы: на фиг, 18 и 19 - выход тока для каждого электрода.Обратимся прежде всего к фиг. 15, Многие представленные здесь данные получают51015 20 25 30 35 40 45 50 55 ученные результаты,при использовании электрохимической ячейки, изображенной на фиг, 15, Она представляет собой ячейку из двух отделений, имеющую основание 1 и кольцевой кожух 2, образующий водную камеру 3, по которой может циркулировать вода для задания температуры ячейки. Эти два отделения соединяются захватывающим резьбовым кольцом 4. В основании 1 центрально расположен платиновый контакт 5, на котором расположен испытываемый диск 6 из бумажного материала электрода, содержащего иммобилизованный фермент, и который удерживается на платиновом контакте при помощи резиновых кольцевых уплотнителей 7 и 8, тогда два отделения ячейки соединены друг с другом,Вверх ячейки, которая, естественно, содержит раствор ферментного субстрата, вставлен стопор 9, поддерживаемый регулируемой втулкой 10, в которой установлен платиновый контрэлектрод 11 и электрод сравнения 12 из серебра и хлорида серебра, Испытания с рабочим электродом проводят под потенциалом 600 мВ, при которых выходной ток измеряют с электрода, имеющего кажущуюся площадь поверхности 0,14 см, открытую для раствора субстрата, Результаты выражены на рисунке в виде плотности тока, т,е, выходного тока, протекающего через единичную площадь электрода (а), открытую для подложки,Как показано на фиг. 16, платиновый контакт 13 окружен контр-электродом сравнения 14, отделенным от него изоляционной втулкой 15. Пористая поликарбонатная мембрана, установленная накольце, используется для удержания испытуемого диска 16 бумажного электродного материала, содержащего иммобилизованный фермент на платиновом контакте. Открытая камера 17 для проб позволяет помещать пробы каплями на мембрану, Электродная ячейка поляризуется потенциалом 325 мВ, а ток контролируется при помощи потенциометра 18, Использование двухэлектродной конфигурации с потенциалом 325 мВ имеет преимущества перед обычной трехэлектродной ячейкой с потенциалом 600 мВ - ею удобно пользоваться и она имеет более низкий фоновый ток, Однако выбор той или иной системы не влияет существенно на рабочие характеристики - стабильность при хранении, стабильность при эксплуатации,линейность характеристики или зависимости от кислорода электродов в соответствии с настоящим изобретением, Ниже подробно рассматривается полЛинейность и зависимость ответов от времени,На фиг, 1 представлены типичные примеры ответа электрода на последовательные добавления глюкозы, дающие конечные концентрации в диапазоне от 0 до 35 мМ, с использованием трехэлектродной ячейки в условиях перемешивания. Все три электрода А, В и С имеют глюкозооксидазу, иммобилизованную на них вышеописанным способом А. Электрод А содержит активированную платинированную угольную подложку в соответствии с настоящим изобретением, а именно - прессованный лист платинированного угольного порошка, связанного полимером (политетрафторэтиленом), подаваемый под торговым знаком Рго 1 о(есп; электрод В содержит электропроводную подложку, вырезанную из части графитового стержня; электрод С содержит электропроводную подложку, вырезанную из выпускаемой промышленностью неплатинированной угольной бумаги, Как показано, электроды В и С дают слабые и сравнительно вялые ответы, напоминающие результаты, даваемые датчиками с посредниками, широко описанными в литературе, Электрод А дает более надежные и устойчивые ответы со временем ответа около 1 с, (" Ш и и" в сигнале, набл юдаемый в верхней части первоначального ответа, частично представляет собой несущественный артефакт в результате способа инжекции, зависящие от глюкозы плато является интересующим сигналом). Все три электрода дают практически линейную характеристику относительно концентрации глюкозы (фиг, 2 результаты показанные только для А и С). Он охватывает диапазон, необходимый для прямого анализа глюкозы в крови (от 0 до 30 мМ), Аналогичные результаты, получаемые с электродами типа А с использованием процедуры иммобилизации В, описанной выше, указывают, что этот метод дает даже еще большую линейность на большем диапазоне,Как показано на фиг, 2, ответ электрода А остается практически неизменным спустя 23 дня, но ответ других электродов со временем ухудшается (как показано для электрода С). Этот тип поведения наблюдается также для других методов иммобилизации, описанных выше, которые все могут использоваться для изготовления чувствительных и стабильных электродов с углеродным материалом, используемым для А, но дают плохие электроды с многочисленными другими неактивными углеродными материалами,Время ответаэлектрода А также остается неизменным спустя 23 дня, в то время как510 15 20 25 30 35 40 45 50 55 другие электроды показывают увеличение времени ответа при начальных временах ответм примерно от 23 до 30 с, которые увеличиваются спустя 8 дней до 2 - 3 мин, Активные электроды (такие, как электроды А) обычно дают некоторое уменьшение ответа в течение первого дня, но затем ответ достигает плато относительно времени, Электроды типа А, которые хранят во влажном состоянии (рН 5,6) при 4 С и проверяют с интервалами в течение 6 месяцев, показывают малые изменения (после первых нескольких суток) и хотя после этого периода наблюдается некоторое ухудшение, ответ спустя 12 месяцев все еще составляет 70; первоначальной величины.На фиг. 1 и 2 представлен выходной ток электрода в МкА см при рабочем напряжении 600 мВ при использовании трехэлектродной конфигурации, изображенной на фиг. 15.Увеличенный срок службы и стабильность электродов в соответствии с настоящим изобретением дополнительно иллюстрируется на фиг,5, на которой показан ответ электрода из глюкозооксидазы, иммобилизованной карбодиимидом, на глюкозу концентрацией 5 мМ после содержания в ацетатном буфере с рН 5,6 при комнатной температуре в течение 180 суток. Сравнительные результаты для электрода известного уровня техники (пример 1) показаны на фиг, 6, Измерения, приведенные на фиг. 5, производят при 600 мВ при помощи трехэлектродной системы, а приведенные на фиг, 6 - при 325 мВ при помощидвухэлектродной конфигурации,Другие сравнения между кривыми ответом для электродов известного уровня техники (пример 1) и электродами в соответствии с настоящим изобретением с использованием различных ферментов и различных методов иммобилизации представлены на фиг, с 7 по 9 - все измерения выполняют при 325 мВ,Кривые ответа для лактата, галактозы и лактозы (комбинация глюкозооксидазы и бета-галактозидазы) приведены на фиг, 10 - 12. Эти изменения выполняют при 600 мВ.Повторное использование электрода: возможность многократных измерений,При постоянной нагрузке электроды в соответствии с настоящим изобретением показывают большой срок службы, что иллюстрируется следующей последовательностью испытаний,Сначала в закрытую ячейку устанавливают электрод из глюкозооксидазы (пример 2) и дают ему возможность реагировать амперометрически на перемешиваемый раствор глюкозы (первоначальный ток 100 мкА). Он работает непрерывно в течение 18 часов, в течение которых сигнал постепенно снизился ниже 10 мкА, Общее количество электричества, которое было получено, соответствовало примерно 75 процентам теоретически ожидаемого (на основании того, что одна молекула глюкозы дает 2 электрона), Этот эксперимент сразу же повторяют с тем же электродом с обновленным раствором глюкозы, после чего первоначальный ток восстанавливается,В последующем эксперименте выдача тока при использовании того же электрода продолжается еще в течение 5 - 7 суток, но подача глюкозы осуществляется циркуляцией из большого резервуара для поддержания концентрации 5 мМ, Выходной сигнал медленно падает в течение 100 ч, но затем стабилизируется на 45 мкМ и эта величина сохраняется еще 40 ч. Возможно, что некоторое количество слабо связанного фермента десорбируется с электрода в течение этого времени либо оказывает влияние какой-либо другой фактор.После описанных длительных испытаний ответ электрода в диапазоне концентраций глюкозы испытывают так, как указывалось выше. Хотя амплитуда сигнала меньше, чем при свежеприготовленном растворе, электрод дает очень хорошую "ступенчатую" функцию в дипазоне концентраций глюкозы от 0 до 30 мМ, что подтверждает, что на него не повлиял какой-либо отрицательный эффект в результате длительного использования под нагрузкой. Этот вывод был сделан при трех последующих испыта- . ниях спустя 1 неделю после хранения (4 С), спустя 8 недель хранения и после нового прогона под нагрузкой, как и прежде в течение еще 4 - 7 суток, ответы в диапазоне концентраций глюкозы остаются неизменными.Эти испытания указывают на то, что электрод может работать в течение общего времени не менее 250 ч (более 15000 мин), что потенциально дает материалу электрода исключительно большой срок службы,Удобство для непрерывного контроля.На уровень конечного ответа, регистрируемый при вышеуказанных испытаниях возможности многократного использования (45 мкА в глюкозе концентрацией 5 мМ), не оказывает влияние воздействие аэрированными растворами, и он остается неизменным после нескольких недель последующего хранения. Стабильность выходного тока электрода в течение 12 ч проверяют в испытании при использовании стерилизованного раствораглюкозы в условиях, направленных на то. чтобы исключить потери глюкозы в результате бактериально 1718011191810 так, как описано, давая хорошие ответы на глюкозу. Пары электродов одинакового размера, приготовленные одной и той же процедурой, дают близко согласующиеся результаты (токовые ответы в пределах нескольких процентов при испытании в идентичныхх условиях).Кроме того, все приготовленные таким образом электроды имели большие сроки службы и долговечность, как говорилось выше, в отличие от глюкозных электродов в соответствии с известным уровнем техники, Таким образом, электроды в соответствии с настоящим изобретением можно надежно хранить и использовать в течение многих недель, в то время как электроды известного уровня техники часто имеют разброс внутри партии.Зависимость бтвета от концентрации кислорода,Для проверки влияния растворенного кислорода испытуемую ячейку видоизменяют - включают в нее кислородный электрод дополнительно к глюкозному электроду. Растворенный кислород выдувают из системы, В этих условиях электрод типа А дает быстрый ответ на введение глюкозы, указывая на существование механизма, в значительной степени независимо от концентрации кислорода в окружающей среде. Такой результат, который приписывается особым характеристикам структуры поверхности электрода в сочетании с хорошей иммобилизацией фермента, не наблюдался ранее,В другом эксперименте (фиг. 4) выходной сигнал электрода типа А (приготовленного вышеописанным методом А) с потенциалом 600 мВ контролируют во время непрерывного продувания аргоном.Одновременно осуществляют измерения давления кислородом в пробе. Результаты, представленные на фиг. 4, показываютпрактически постоянный токовый сигнал (верхний график), который практически независит от давления кислорода в пробе (нижний график), В другом испытании сиг 15 20 25 30 35 40 45 50 55 го загрязнения. Сигнал остается постоянным втечение всего времени, что указывает, что прекратились влияния первоначального"кондиционирования" электрода в перемешиваемом и циркулирующем растворе в течение нескольких дней, Такие электроды, соответствующим образом кондиционированные, найдут применение там, где требуется непрерывный контроль глюкозы,Восп роизводимость партийПри условии, что поддерживаются необ-. ходимые "чистые" условия приготовления, все электроды, изготовленные в соответствин с настоящим изобретением, работают нал практически не испытывает влияния втечение 10 мин, в то время как давлениекислорода быстро падает, На другом электроде (приготовленном методом В) отмечается уменьшение тока ниже 50 в течениевремени более 3 мин, в течение которогосодержание кислорода снижается до 90 .Увеличение токового ответа наблюдаетсятакже и тогда, когда кислород вновь вводятв систему, хотя такое увеличение происходит сравнительно медленно, При длительной продувке аргоном электроды реагируюттолько на узкий диапазон концентрацийглюкозы, возможно, чтодля "срабатывания"той части функции фермента, которая отвечает за окисление субстрата, требуется присутствие следов кислорода. Кроме того,нельзя исключить возможность того, чтокислород, адсорбированный на электроде(при малой концентрации не выявляемыйкислородным электродом), играет какую-тороль в этом поведении.Загрузка ферментом.Независимые измерения скорости снижения количества глюкозы и максимальныхплотностей тока показывают, что количество фермента, активно иммобилизованногона электроде (типа А). эквивалентно примерно 7 мг активного фермента на квадратныйсантиметр поверхности электрода, При процедурах иммобилизации установлено, чтодаже в тех случаях, когда раствор ферментаразбавляют в 10 раз, все же можно былоприготовить очень активные электроды,Зависимость ответа от температуры.Электроды типа А испытаны в диапазоне концентраций от 0 до 30 мМ глюкозы притемпературе от 10 до 37 С, Температурныйкоэффициент составляет от 2 до 370 на градус(что соответствует энергии активации Аррениуса, равной приблизительно 24 кДж мольЗависимость от рН.Наблюдается небольшая зависимостьответа от рН, Однако в пределах рН от 7 до8 ответ практически не зависит от рН заисключением случаев очень больших уровней глюкозы (более 25 мМ),Ответ электрода. покрытого защитноймембраной,Установлено, что поликарбонатная мембрана вносит мало изменений в форму ивеличину ответа электрода перемешиваемой системы, Время ответа в неперемешиваемой системе составляет около 20 с,Использование электрода для анализапроб цельной крови,Электрод с поликарбонатной мембраной успешно используется для прямых измерений глюкозы в крови, Помехи состороны аскорбата при 0.2 ммоль/л состав