Способ определения активности щелочной фосфатазы

ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Социалистических Республик(51)М. Кл.36 01 й 21/78 С 01 й 33/50 с присоединением заявки М Государственный комитет СССР по делам изобретений н открытий.432(088.8) Дата опубликования описания 25. 12. 80(сГидрохимический институт Государственногочцми+е;са;,:,-.гидрометеорологии и контроля природной среды ЙС 6(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ15 Отличительным признаком способаявляется использование в качествесубстратао-нафтилфосфата и обработка полученного раствора 4-бенэоил амико,5-диметоксианилином.Способ иллюстрируется следующимпримером.60 мп о -нафтилфосфата растворяют в 10 мл дистиллированной воды, 25 нейтрализуют до рН=7,05 растворомбикарбоната натрия и доводят объемраствора де 20 мл, К 0,7 мл приготовленного раствора сС -нафтилфосфатаприливают 0,7 мл ОЗМ карбонатно-би карбонатного буфера рН=10,0 и 0,2 мл Изобретение относится к аналитической химии,а именно,к способам определения активности щелочной фосфатазы,Известен способ определения активности щелочной фосфатаэы путем обработки анализируемой пробы раствором и-нитрофенилфосфата в присут" ствии 1,5-4,5 М раствора солянокислого диэтаноламина с последующим спектрофотометрированием полученного раствора 1.Недостатком способа является сложность определения.Наиболее близким к описываемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ определения активности щелочной фосфатаэы, заключающийся в обработке анализируемой пробы субстратом, состоящим иэ глицинового буфера, содержащего хлористый магний и раствора и-нитрофенилфосфата с последующим нагреванием полученного раствора при 37-39 оС в течение 30 мин иохлаждением на ледяной бане, добавлением к охлажденному раствору йаОН и спектрофотометрировании полученного окрашенного раствора 21 .Недостатками способа являются егс сложность и нестабильность окраски конечного Фотометрируемого продукта.Цель изабретения - упрощение способа и повышение стабильности окрас ки раствора.Поставленная цель достигается описываемым способом определения активности щелочной фосфатазы, заключающимся в обработке анализируемой про бы с- нафтилфосфатом (субстратом)и4-бензоиламино,5-диметоксианилиномс последующим спектрофотометрированием полученного окрашенного раствора.789712 20 Предлагаемый способ Известный способ Показатели 6,7 ТочностьЧувствительность 6,0 5,3 Объем пробы 2,75 мл.СФА,толщина слоя кюветы 1 смдиапазон линейной зависимости от 0 до 0,18 мк.мбль п-нитрофенола Объем пробы 5 мл.СФА,толщина слоя кюветы 1 смдиапазон линейной зависимости от 0 до 0,14 мк, моль Ф -нафтола.Длительностьодного определения 45 мин 45 мин Устойчивостьконечного окрашенного раствора(2-3 суток при хранениив темноте) 15 мин Источники информации,55 принятые во внимание при экспертизе 1. Патент Англии Р 1524916,кл. 6 01 Н 31/14, 1978. 2. Веььеу О.А. огюгу О,О. Вгос 3 с М,1. 1.В 1 о 1. СЬеп. 1946, 9 1,д р. 321 (прототип), ВНИИПИ Заказ 9023/36 Тираж 1019Подписное Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул, Проектная, 4 супернатанта, полученного после центрифугирования гомогена при 7000 об/мин в течение 10 мин. После 30-минутной инкубации при 37 оС приливают О, мл 2 раствора соли 4-бензоиламино-2,5-диметоксианилина и оставляют на 3 мин. За это время происходит связывание образовавшегося в результате ферментативной реакции а -нафтила с 4-бенэоиламино,5-диметоксианилином Останавливают ферментативную реакцию добавлением 0,2 мл 20 раствора йаОН. Затем приливают 1 мл дистиллированной воды и 2 мл ацетона для растворения образовавшегося комплекса о-нафтола с красителем. Окрашенный раствор фотометрируют при длине волны 530 нм на спектрофотометре.Активность фермента находят по величине экстинции при помощи калибровочного графика, который строят следующим образом.В пробирку помещают 2-20о: -нафтола, 0,7 мл ОЗМ карбонатно-бикарбонатного буфера рН=10,0, доводят Известный способ имеет существенный недостаток - нестабильность ко,нечного фотометрируемого раствора и сложность определения.Основное достоинство предлагаемого способа - получение окрашенногокомплекса-нафтола с 4-бензоиламино,5-диметоксианилином, устойчивого в растворе ацетона в темФноте в течение 2-3 суток, что позводяет использовать предлагаемый способ в полевых условиях в качестве экспресс-метода для энзимодиагностики состояния природных вод,Формула изобретенияСпособ определения активности щелочной фосфатазы путем обработки объем до 1,6 мл дистиллированной водой, приливают 0,2 мл 0,2 раствора соли 4-бензоиламино,5-диметоксианилина, через 3 мин приливают 0,2 мл 20 раствора НаОК, затем 1 мл воды и 2 мл ацетона. Фотометрируют при=530 нм на спектрофотометре Активность фермента щелочной фосфатазы выражают в единицах Е/ч, означающих число микромолей с -нафтола, освобожденного 1 г ткани в течение 1 мин в данных условиях, Рассчитывают активность щелочной фосфатазы по о муле ф р35 где А - активность фермента, выраженная. в единицах Е/ч;С - концентрация Ф - нафтола,освобожденного в результате реакции, выраженная вмикромолях. В таблице приведены сравнительные данные определения щелочной фосфатазы известным и предлагаемым способом. анализируемой пробы субстратом 45 с последующим фотометрированием полученного раствора, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и повышения стабильности окраски раствора, в качествесубстрата используют ОС -нафтилфосфат и полученный раствор обрабатывают 4-бенэоиламино,5-диметоксианилином.