Способ получения алкогольдегидрогеназы

(и 553283 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз Советских Социалистических Республик(61) Дополнительное к автсвидь тс51) М, Кл.з С 120 13/1 О 2) Заявлено 19.12.75 (21) 2300688/13 с присоединением заявки Ме Государственный комите Совета Министров СССР по делам изобретенийн открытий(23) Приоритет Опубликовано 05.04.77. Бюллетень МеДата опубликования описания 26.04.77 53) 1,К 577,5.6. Эзис, А, Ф. Лидере и А. М, Иргенсесоюзного ордена Трудового Красногедовательского института химических истых химических веществ ИРЕА нзоорстени я71) Заявитель 3. А. Виестуре, Р, ЯЛатвийский филиал ВЗнамени научно-иссл реактивов и особо 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗЪ ацетальдспеназа; фермент алкогольдеаэробные условия;перемешиванис.Таким образом пооводят кльтивиро дро гаемому способ исходного дпожпредл ванне 0 пр Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам получения (рермента - алкогольдегидрогеназы, применяемого в молекулярной биологии и медицине для лечения нервных заболеваний, например алкоголизма.Известен способ получения алкогольдегидрогеназы из оиомассы дрожжей, включающий плазмолиз дрожжей толуолом, осажденис фермента сульфатом аммония и его кристаллизацию.Активность алкогольдегидрогеназы после первой перекристаллизации 62,40 ед/мг белка 111.Активность алкогольдегидрогеназы зависит от качества биомассы дрожжей,Недостатком известного способа является низкий выход, т. е. низкая активность алкогольдегидрогеназы в первоначальном экстракте биомассы дро 1(кей, так как обработка биомассы перед выделением для повышения активности алкогольдегидроген азы не проводится.С целью повышения выхода фермента по предлагаемому способу перед плазмолизом дрожжей толуолом дрожжи активируют путем культивирования их на питательной среде, содержащей фосфат калия в течение 1 - 6 ч, а затем в питательную среду вводят этанол, витамины группы В, соль цинка и осуществляют культивирование в течение 3 - 6 ч,Согласно описываемому способу проведением культивирования биомассы дрожжей с активностью 0,11 - 0,30 ед/мг белка получают биомассу дрожжей с активностью 0,86 - 1,80 ед/мг белка.Выход алкогольдегидроген азы повышается благодаря дополнительному культивирова. нию исходной биомассы дрожкеи.Культивирование исходной биомассы дрожжей проводят в две стадии. На первой стадии введением фосфата калия происходит активация ферментных систем клетки, в том числе ферментов цикла гликолиза. Это достигается путем частичного и обратимого блокирования окислительных келезоферментов дрожжей, в результате чего дыхание клетки частично тормозится и поэтому активируется анаэробная фаза дыхания. На второй стадии добавлением этанола в качестве индуктора активности алкогольдегидрогеназы вместе с биологически активными веществами в ферментационной среде осуществляется следующая реакция:1 С 30 Сэтанол - 1 дИ 3283 Формула изобретения 35 40 45 1970,Составитель Т, СеребренниковаРедактор Л, Гончарова Техред Н, Сметанина Корректор О, Тюрина Заказ 764/5 Изд493 Тираж 589 Подписное Цг 1 ИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Рауьнская наб., д. 4/5Типография, пр. Сапнова, 2 жевого сырья. Биомассу дрожжей (500 г прессованных дрожжей на 1 л среды) суспендируют в растворе фосфата калия (2,7% КН,РО 4) и при непрерывном перемешивании и аэрации культивируют 2 - 6 ч. Температура культивирования 25 - 35 С, рН среды 4,5 - 5,5. Затем к ферментационной среде добавляют этанол, витамины группы В (ВьВ В, - биотин) или их источники и соли цинка. Процесс культивирования продолжают еще 3 - 6 ч. Лктивность алкогольдегидрогеназы в биомассе дрожжей 1,8 ед/мг белка, Дрожжи плазмолизируют толуолом, фермент осаждают сульфатом аммония с последующей его кристаллизацией,П р и м е р 1. В качестве исходного сырья используют биомассу спиртовых дрожжей Ьасс 1 агоп 1 усез сегечЫае. 1500 г прессованных дрожжей с активностью алкогольдегидрогеназы 0,3 ед/мг белка подвергают культивированию в реакторе емкостью 10,0 л, В первой стадии культивирования применяют питательную среду, состоящую из 81,0 г КНРО 4 и 1,5 л воды. Температура культивирования 30 С. В реактор через распределитель подают стерильный воздух (3 л/мин), Культуральную жидкость перемешивают со скоростью мешалки 600 об/мин,После 3 ч начинают вторую стадию культивирования биомассы дрожжей и в реактор добавляют 150,0 мл этанола, 15,0 г экстракта дрожжей и 4,5 мг ХпС 1, 6 НО, После этого процесс культивирования дрожжей при данном режиме продолжают 6 ч.Полученную биомассу дрожжей отделяют от культуральной жидкости на вакуумном фильтре. Концентрация алкогольдегидрогеназы в биомассе 1,8 ед/мг белка. В сравнении с исходным сырьем активность алкогольдегидрогеназы повышается с 0,3 до 1,8 ед/мг белка.Дрожжи плазмолизируют толуолом, экстракт фракционируют сульфатом аммония с последующей кристаллизацией фермента, Получают ферментативную активность алкогольдегидрогеназы 65,3 ед/мг белка,П р и м е р 2. В качестве исходного сырья используют биомассу хлебопекарных дрожжей Бассагогпусеэ сегечЫае. 1500 г прессо 5 10 15 20 25 30 ванных дрожжей с активностью алкогольде. гидрогеназы 0,11 ед/мг белка подвергают культивированию в реакторе емкостью 10 л.В первой стадии культивирования применяют питательную среду, состоящую из 81,0 г КНР 04 и 1,5 л воды. Температура культивирования 30 С. В реактор через распределитель подают стерильный воздух (3 л/мин). Культуральную жидкость перемешивают со скоростью мешалки 600 об/мин.После 3 ч начинается вторая стадия культивирования биомассы дрожжей и в реактор добавляют 180,0 мл этанола, 15,0 мг витамина В 15,0 мг витамина Вь 15,0 мг витамина Вв, 0,3 мг биотина и 4,5 мг ХпСз 6 НзО.После этого процесс культивирования дрожжей продолжают 6 ч,Полученную биомассу дрожжей отделяют от культуральной жидкости на вакуумном фильтре. Концентрация алкогольдегидрогеназы в биомассе 0,86 ед/мг белка.В сравнении с исходным сырьем активность алкогольдегидроген азы повышается с 0,11 до 0,86 ед/мг белка. Ллкогольдегпдрогеназу из биомассы дрожжей выделяют, как в примере 1.Предлагаемый способ обеспечивает повышение активности адкогольдегидрогеназы в биомассе дрожжей до 0,86 - 1,80 ед/мг белка Способ получения алкогольдегпдрогеназы из биомассы дрожжей, включающий плазмолиз дрожжей толуолом, осаждение фермента сульфатом аммония и его кристаллизацию, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода фермента, перед плазмолизох 1 дрожжей толуолом дрожжи активируют путем культивирования их на питательной среде, содержащей фосфат калия в течение 1 - 6 ч, а затем в питательную среду вводят этанол, витамины группы В, соль цинка и осуществляют культивирование в течение 3 - 6 ч.Источник информации, принятый во вни мание при экспертизе1. Журнал Восшеппса,1 опгпа, 118, 375.