Способ получения автолизата дрожжей-сахаромицетов

// (С 1/06, А 23,1 1/18//1/06 С 12 Б. 1:86 ОПИСА Н АВТОРСНО Е ИЗО НИЯ ДЕТЕЛЬСТВУ СВИ 13 словий на авого универси(54) СПОСОБ П ДРОЖЖЕЙ-САХАР (57) Изобрете биологической быть использо игристых вин. шение качеств ЛИЗА ЛУЧЕНИЯМИЦЕТОВ сится к микроенности и может производстве обретения - повызата, Способ отн промышл ано при Цель из .автоли чив про ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТПРИ ГКНТ СССР(56) Патент США У 4218481,ф кл, А 23 Х 1/18, 1980.Проект технических утолизат дрожжей Дитонсктета, Франция, 1988. Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частнос ти к способам получения автолизата дрожжей, и может быть использовано в винодельческой промьпдленности при производстве игристых вин,Цель изобретения - повышение ка чества автолизата.Способ заключается в том, что на первом этапе продолжительностью 6- 12 ч дрожжи-сахаромицеты вьщержив т в растворе экстрагента, в качестве которого применяют раствор хлористоБО 1606528 заключается в том, что процесс автолиза ведут в два этапа: на первомэтапе дрожжи выдерживают в течение6-12 ч в растворе хлористого калияили хлористого кальция,или бикарбоната калия, или зтилендиаминтетрауксусной кислоты концентрацией 0,1-0,15 Мпри рН 7,5-10,5 и 20-50 С; на втором этапе дрожжи выдерживают также6-12 ч в буферном растворе при рН 4,56,5 и температуре 42-60 С. После отделения оба автолизата объединяют иочищают от низкомолекулярных веществ.За счет оптимальных условий действияпротеолитических ферментов концентрация общего азота в автолизате увели- ачивается в 2,0-2,5 раза, а концентрация белкового и пептидного азотав 20-22 раза. В автолизате сохраняется активность гидролитических ферментов дрожжей, которые воздействуя набиополимеры вин, обеспечивают ихстабилизацию, 2 табл. го калия или хлористого кальция, или бикарбоната калия, или ЭДТА в концентрации 0,1-0,15 М, поддерживая рН 7,5-10,5 и температуру 20-50 С,о Полученный автолизат, содержащий продукты гидролиза, под воздействием протеиназы 1 (пептиды и аминокислоты) отделяют от дрожжей, а последние помещают в другой экстрагент - буферный раствор (например,. ацетатный, универсальный и др.), обеспеающий условия активного действия тенназы 11, На втором этапе про 3 1606528должительностью 6-12 ч дрожжи выдерживают в буферном растворе при рН4,5-6,5 и температуре 42-60 С. Полученный автолизат отделяют от дрожжей5одним из известных способов, например центрифугированием, и объединяют с автолизатом, полученным на первом этапе, а затем смесь очищаютот низкомолекулярных веществ однимиз известных способбв, например диализом, Наиболее эффективной являетсявыдержка дрожжей на первом этапеавтолиза при . рН 9,0 и температу.37 С а на втором этапе - при р 1" 5,9ьи температуре 50-55 С. Полученный врезультате применения предлагаемогоспособа автолизат характеризуется высоким содержанием азота, разнообразием его форм, а также ценными биологическими свойствами, обеспечивающими стабилизацию вин против коллоидных помутнений.Сравнительная характеристика автолизатов по концентрации азотистых . 25веществ и протеолитической активности приведена в табл,1.Пептиды и белки являются поверх. - ,ностно-активными веществами, которыеиграют решающую роль в формированиипенистых свойств игристых вин, поэтому при разработке предлагаемогоспособа стремились получить автозщзатс повьппенным содержанием пептидногои белкового азота.Кроме того, что протеолитическиеферменты целесообразно использоватьв виноделии для стабилизации вин против коллоидных помутнений,В автолизате, полученном по пред лагаемому способу, протеолитические ферменты (протеиназы 1 и 11) сохраняются в активной форме, благодаря чему при введении такого автолизата в шампанизируемое кюве не только по вьппаются пенистые свойства шампанс- кого, но и достигается стабилизация его против коллоидных помутнений за счет использования активности собственных ферментов дрожжей.50П р и м е р 1 (по известному спо,собу). Дрожжи осажденные расы Феодосия 1-19 вида ЯассЪагошусез сегечхзъае в количестве 100 г помещают в 500 смф 103-ного спиртового раствора55 с рН 5 0 и в течение 18 ч выдерживаЭют при 45 С. Затем смесь центрифугируют. В отделенном от дрожжей автолизате определяют активность протеолитических Ферментов по гидролизу1аэоказеина и концентрацию различныхформ азота (опыт 1 табл.2), Затемпроводят инактивацию ферментов термическим шоком при 75 С. Измерения показывают, что протеолитическая активность в автолизате исчезает (опыт 2табл.2),П р и м е р 2 (предлагаемый способ при оптимальных режимах), Осажденные дрожжи расы Феодосия 1-19ассЪаготусез сегечздае в количестве100 г помещают в 250 см 0,1 М раст-.вора бикарбоната калия, доводят рНсмеси до 9,0 1 н, щелочью ИаОН и втечение 12 ч выдерживают в термостате при 37 С, после чего. дрожжи отделяют центрифугированием от полученного автолизата, помещают в 250 см0,2 М ацетатного буфера с рН 5,0 ив течение 12 ч выдерживают в термостате при 55 С, Затем смесь центриФугируют и отделенный от дрожжей автолизат объединяют с автолизатом, по;лученным на первом этапе. Для отделения низкомолекулярных веществ(солей, кислот и т.д.) проводят диализ смеси. В полученном автолиэатеконцентрация азота составляет,мг/дмз: общий 430; аминный 100; пептидный и белковый 201; активность протеолитических ферментов составляет10,2 ед/г (опыт 3 табл.2),П р и м е р 3. Способ осуществля.ют в той же последовательности и ссоблюдением тех же режимов, что и впримере 2, но в качестве источникаазотистых веществ и протеолитическнхФерментов используют молодые винныедрожжи расы Феодосия 1-19, отделенныеот бродящего виноградного суславо время экспоненциальной фазы ихроста. В полученном автолизате концентрация азота составляет, мг/дмобщий 432, аминный 98; пептидныйи белковый 205; активность протеолитических ферментов составляет12,0 ед/г (опыт 4 табл,2),П р и м е р 4. Способ осуществляют в той же последовательностии с соблюдением тех же режимов,что и в примере 2, но в качестве источника азотистых веществ в протеолитических ферментов используют осажденные винные дрожжи расы 47-К. В полученном автолизате концентрацияазота составляет, мг/дм : общий435; аминный 96; пептидный и белколэ 28 50 55 5160вый 212, протеолитическая активностьсоставляет 10,5 ед/г (опыт 5 табл,2),П р и м е р 5,. Способ осуществляют в той же последовательностии с соблюдением тех же режимов, что ии в примере 2, но в качестве экстрагирующего раствора на 11 этапе автолиза используют универсальный буферс рН 5,0. В полученном автолизатеконцентрация азота составляет, мг/дм:общий 428; аминный 98; пептидныи ибелковый 200; активность протеолитическнх ферментов составляет 10,4 ед/гопыт 6 табл.2),П р и м е р 6. Способ осуществляют в той же последовательности ис соблюдением .тех же режимов, что ив примере 2, но на 1 этапе автолизадля улучшения проницаемости дрожжевых оболочек и экстракции продуктовгидролиза дрожжевого белка в раствор вводят различные реагенты, применяемые для этих целей в практикебиохимии: 0,05-0,5 М КС 1; 0,050,5 М СаС 1, 0,05-0,5 М ЭДТА; 0,50,5 М НаС 1; 20%-ный ацетон; 20%-ныйхлороформ; 20 -ный толуол; 20%-ныйэтиловый спирт (опыты 3, 7-3 табл.2).Лучшие результаты получены при использовании ЗДТА, солей хлорида калияхлорида кальция, бикарбоната калияв концентрациях не менее 0,1 М, В полученных автолизатах концентрацияазота составляет, мг/дм: общий 380430; аминный 46-100; пептидный ибелковый 156-12; протеолитическаяактивность составляет 8,2.-12,0 ед/г(опыты 3, 7-13 табл.2). В вариантахпредусматривающих использование указанных экстрагентов в меньших концентрациях (опыты 20-23 табл.2) и других реагентов (опыты 14-19 табл.2),получены автолизаты с недостаточнойконцентрацией азотистых веществ и незначительной протеолитической активностью, Так, концентрация общего азота в них составляет 10-230 мг/дм3аминного азота 0-40 мг/АР, пептидного. и белкового азота 0-100 мг/дмз;протеолитическая активность составляет 0-4,5 ед/г.П р и м е р 7, Способ осуществляют в той же последовательностии с соблюдением тех же режимов, чтои в примере 2, но варьируют продолжительностью вьдержки на обоих этапахприготовления автолизата (опыты 24-29табл.2), Снижение времени выдержки до б ч при одвт к снижению качестваавтолизата на 40-47 ., которое выра.жается в концентрации общего азота,234-287 мг/дм ; аминного азота 475,50 мг/дм , пептидного и белковогоазота 92-96 мг/дмэ и активности протеолитических ферментов 5,2-5,4 ед/г(опыты 24-26 табл.2) . Дальнейшее снижение вьдержки приводит к потере качества автолизата на 50 Х и более ивыражается в концентрации общего азота 162-212 мг/дмз, аминного азота32-44 мг/дмь, пептидного и белковогоазота 68-77 мг/дмЭ и активности протеолитических ферментов 3,0-4,8 ед/г(опыты 27-29 табл.2).П р и м е р 8, Способ осуществляют в той же последовательности и с2 О соблюдением тех же режимов, что и впримере 2, но варьируют величиной рНна первом этапе автолиза. Для этогодоводят экстрагирующий раствор дорН 7,0; 7,5; 9,0; 10,5; 11,0 (опыты25 3, 30-34 табл.2) . Результаты показывают, что автолизаты, приготовленныепри рН 7,5-10,5, на первом этапесодержат концентрацию общего азота212-430 мг/дм, аминного азота 6530 1 00 мг/дмз, пептидного и белковогоазота 150-201 мг/дм, а активностьпротеолитических ферментов составляет 5,0-10,2 ед/г (опыты 3, 31-32.табл.2). Дальнейший сдвиг рН в щелочную или кислотную зону приводит кснижению концентрации азотистых веществ и протеолитической активностиболее, чем на 50 от величины этихпоказателей при оптимальном рН 9,040 (опыты 30,33 табл 2),П р и м е р 9, Способ осуществляют в той же последовательности и ссоблюдением тех же режимов, что и впримере 2, но варьируют величиной45 рН на втором этапе автолиза. Для этого доводят экстрагирующий раствор до рН 4,0; 4,5; 5,0; 6,5; 7,0 (опыты 3, 34-37 табл.2). Результаты показывают, что автолизаты, приготовленные при рН 4,5-6,5 на втором этапе, содержат концентрацию общего азота 198-430 мг/дмЗ, аминного азота 52 - 100 мг/дм, пептидного и белкового азота 158-201 мг/дм , а активностьЬпротеолитических ферментов 5,5- 1 О, 2 ед/г (опыты 3, 35-36 табл,2),Дальнейший сдвиг рН в щелочную или кислотную зону приводит к снижению протеолитической активности и кон 160652825 центрации азотистых веществ более, чем на 50 от величины этих показателей при оптимальном рН 5,0 (опыты 34, 37 табл,2).П р и м е р 10, Способ осуществляют в той же последовательности и с соблюдением тех же режимов, что и в примере 2, но варьируют температурой на первом этапе автолиза, Для этого температуру доводят до 18, 20, 37, 50 и 52 С (опыты 3, 38-41 табл.2). Результаты показывают, что автолизаты, приготовленные при температурах 20-50 С на первом этапе автолиза, содержат концентрацию общего азота 182-430 мг/дмэ, аминного азота 60- 100 мг/дм , пептидного и белкового азота 104-201 мг/дР, а активность протеолитических Ферментов 6,0- 10,2 ед/г (опыты 3, 39-40 табл.2), Автолиз при температуре ниже 20 С и выше 50 С снижает протеолитическую активность и концентрацию азотистых веществ в автолизате более, чем на 50% от величины этих показателей при оптимальной температуре 37 С (опыты 38, 41 табл.2).П р и м е р 11, Способ осуществляют в той же последовательности и с соблюдением тех же режимов, что и в примере 2, но варьирует температурой на втором этапе автолизат. Для этого температуру доводят до 40, 42, 55, 60 и 62 С (опыты 3, 42-45 табл.2). Результаты показывают, что автолиза 35 ты приготовленные при 20-50 С на втором этапе автолиза, содержат концентрацию общего азота .200-430 мг/дм 1 аминного азота 54-100 мг/дм, пептид ного и белкового азота .98-201 мг/дмз, а активность протеолитических Ферментов 5,4-10,2 ед/г (опыты 3, 43"44 табл,2). Лвтолиз при температуре ниже 42 С и выше 62 С снижает протеоли тическую активность и концентрацию азотистых веществ в автолизате более, чем на 50% от величины этих показателей при оптимальной температуре 55"С (опыты 42, 45 табл.2).Характеристика автолизата дрожжей в зависимости от режима автолиза приведена в табл,2.Из данных табл.2 следует, что на осуществление предлагаемого способа раса дрожжей-сахаромицетов и их Физиологическое состояние не оказывают существенного влияния, Снижение времени автолиза до 6 ч на каждом в отдельности или на обоих вместе этапах ведет к незначительной потере концентрации азотистых веществ и протеолитической активности (теряется 1 Опо сравнению с вариантами с выдержкой 12 ч), а дальнейшее снижение времени автолиза ведет к потере 50 , что снижает ценность полученных автолизатов, Выбор режимов (температура, рН) проведен из соображений экономической целесообразности, которая заключается в следующем: внесение в игристое вино автолизата с концентрацией пептидного и белкового азота не менее 80 мг/дм обеспечивает повышение его пенистых свойств не менее, чем в 1,5 раза, применение же автолизата, с меньшей концентрацией пептидного и белкового азота для достижения таких же пенистых свойств потребует недопустимого разбавления вина. Из применяемых на первом этапе автолиза реагентов лучшими являются хлористый калий, хлсристый кальций, бикарбонат калия и ЭДТА в концентрации 0,1-0,15 М. Для создания рН на втором этапе автолиза природа применяемого буФера не имеет значения.Таким образом, преимущество предлагаемого способа по сравнению с известным заключается в повышении активнос" ти протеолитических Ферментов дрожжей в 2-2,5 раза за счет оптимизации условий их действия и, как следствие, повышение качества автолизата за счет обеспечения перевода в автолизат максимального количества азота, представленного значительно большим, чем в известном, разнообразием. Так, концентрация общего азота увеличивается в 2-2,5 раза, а пептидного и белкового азота - в 20-22 раза, Кроме того, исключение термической обработки автолизата позволяет сохранить его биологиески ценные свойства, заключающиеся в сохранении активности гидролитических Ферментов дрожжей, которые воздействуя на биополимеры вин, обеспечивают их стабильность.Формула изобретенияСпособ получения автолизата дрожжей-сахаромицетов, предусматривающий выдерживание дрожжей в растворе экстрагента и отделение автолизата отдрожжей, о т л и ч а ю щ и й с я тем1606528 10 что, с целью повьппения качества автолизата, выдерживание дрожжей осуществляют в два этапа, продолжительность6-12 ч каждый, при этом на первомэта)ге в качестве экстрагента используют раствор хлористого калия илихлористого кальция, или бикарбонатакалия, или этилендиаминтетрауксусХарактеристикаавтолизата Способ Известный Предлагае 210 215-435 105 46-100 45 86-212 0 5,0-12,0 Табдмпа 2гаратересее автопмэата Река катава Раса и Фаэа роста дровкед еонкектрапнв авета, мт/дн э амтмзюстапротеодмтмфескнк Фер"ментов,едlт Тетаературае СВрем мдерпкм, к эс тра гмрумпнд раствораннмв 0 ептмдн н бенков 1 этак И этап 1 этап 21 этап 1 этю П этан 1 этап 11 этап 5,0 45 в 102 е. одно- спмртома 1 Феодосн 1-19осаннмне (а- тонн эат до кока) 2 Фадоена19осклепаю (автоамэат вослетермпока)3 Феодоснв 1-19осадамне 210 105 45 1 В 50 45 О,г оо го 37 55430 5,0 9,О 12 12 о, к Адтата ЬУФер 2,0 5,0 12 12 бедоска 1-9 в экспооке намФ Фаэе роста3 раса ачосаннкма 6 Феодосмк 1 19осанаеме 37 55 435 12 12 90 96 212 96 200 о,зз,о 5,0 37 О,а 55 420 2 12 90 Уммверсювк буФер АмтатЬУ Фер О,1 К вйсоэ 5,0 37 о,о 92 Вз 12 12 9,0 0, Ксс 1 37 55 390 В,г 65 160 5 0 90 12 12 12 12 90 50 1 О 11,0 9 В 200 94 1 ОЕ 67 56 з,о 9,0 70,2 з,о 9,0 9,0 з,о е,гз,о 9,0 9,0 5,0 о,в 6 а 55 Э 7 0 КСаС 1 с00,5 КККС 0о,з кСС 1о,з кСС 1 а0,5 к7 ДТА0, Къс 1о,з кПС 12(12+ Концентрация азота, мг/дмобщего аминного пептидного и белкового Протеолитическая активность, ед/г 12 , 12 1 г 12 12 12 12 2 2 2 г г 2 12 ной кислоты в концентрации0,10-0,15 М при рН 7,5-10,5 и температуре 20-50 С, а на втором - буферный раствор при рН 4,5-6,5 и тер 1 пературе 42-60 С, а после отделенияот дрожжей оба автолиэата объединяют и очищают от ниэкомолекулярныхвеществ.Таблица 1 210 9 В 4 Ь 42 37 55 аэг 90 гоз 37 55 ЗВО 46 102 37 55 аэо 37 55 аоо5537 55 ЗВО Э 7. 55 166 37 55 16 ВРенин автолиэа Раса и фаэ та дровней рактеристика автолизата фцентрациа азота, мг/3 пфэ Активностьпротеолнтн-Обвий Амнниый Пептиде ческнк ферный и ментов, белковый ед/г102 35 62 0,5 тир 3 пщнй мне рату оСмя выдерн- и 11 этап 1 этап 11 эт этап 11 этап 7 этап П э 1 5,а Аде татный брафер 12 нв 1 19,О 5 5 9 131100 4 Э 42 47 37 10,2 10,3 5 325 35 7 и еффе 5,0 5,0 и Составитель В,Голимбе Техред МфХоданич Малец Коррек едактор Н,Горва Заказ 3 ВНИИПИ исное открытиям при ГКНТ С д. 4/5 Под по изобретениям -35, Раушская н сударств 1