Перхлорат 1, 3-диметил-5-ацетоксибен-зимидазолия как субсрат ферментов

Союз Советских Социалистических Республикасудерстненный иеиитеСвветв Министров ССОРпе делен инЮРетенийю етхР 51 тий(088.8) 5) Дата оаубяиковаиии оиисакди О 4.06,76 72) Авторы ваобретенк-ДИ МЕТИЛ-ЛЦ ЕТОКСИБЕНЗИМИДАЗОАИБСГРЛТ ФЕРМЕНТОВ относительно дефицитанизидин,яется создание флуо. определения катали 1 етов, например хо. лениен ты под, ное и дЦелью сырь тения ГОР зобре убст ратов для рогенных тической ости фер ее устойч субстрат путем, че цель дос актив аых к спонтацному1 и синтезируемых м этот субстрат.игается применением субстрата перхлнзимидазолия фо 5-ацетокси Изобретение относится к производству бензимидазола, которое можно использовать в качестве флуорогенного субстрата холиэстераз.Известно применение в качестве флуорогецных субстратов холинэстераз сло;кных эфирсв различных оксисоедицений,Однако избирательными субстратами холин-эстераз являются только те вещества, моль. кулы которых содержат катионный центр, как это имеет место у природного субстрата холинэстераз-ацетилхолина. Лучшим флуороген- ным субстратом этого типа является 1-метил 7-ацетоксихинслиний (субстрат 11. Недостатками известного субстрата 1 являются высокая скорость спонтанного г 11 дролиза (низкая гпдролитцческая стойкость), относительно сложные методы 11 олуче 1;11 я ромежуточиого продукта в синтезе субстрата 3 (7-бксихинол 1 н 111, которь 1 е включают трудно;оцтролиру(му н) 411 кц 1 ю Скрау нп, К 3 йю."е того Для ЦР 011 ОДГН 11 Я ".Т 11, 1:И 1 П ЕЗОВ 1 Н.САХОД 1."10 11 ГЦОЛЬ 11 Н. т Л 11(1 З 11 аЛЬ 11 Ю ац 1 Ц 1 РатУРт ДЯ Ра 1 ф линэстераз бол, гидролизу, чем 1 более простымПоставленная 1 Ов качестве флта 33-д 11 метил- мулыг;СПГ(Формула изобретения Н СЖО СНкак субстрат ферл нтов,Составитель Г,Жукова Редактор З.Горбунова Техред А,Камышникова Корректор 1,ПовщпсовскадЗвказ 5 ЦЯ Изд. М Яг Тн раж,"29 1 о ЦНИИПИ Гоеударственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, 113035, Раушекав наб, 4. зИсходным веДе(тэом и (иитмз( ир(;(,елого субстрата является менее (ефиции 1 и, чс(мманизидин, и б лее дешевый - и анизидин,Промежуточные продукты в синтезе предлагаомого флуорогенного с.убстратн (1.нлкил.5.окси.бенэим 1 дазолы) получают простым способом,который требует специальной, аппаратуры и невключает трудно контролируемых реакций,Предлагаемое соединение получают общеиз-вестным способом, а именно соль 1,3 диметил.-5.6 ксибензимидазол ия(обрабат вакт нгидридо. или галоидангидридом карбоновой кэсло-П р и м е р, К раствору 5 г (0,03 моль)1.метил-оксибенэимидазола в 150 мл диметил 1 бформамида приливают 75 мл диметилсульфатаи реакционную смесь нагревают при 120-130 оС4 час, Затем отгоняют в вакууме раствори-;тель, остаток растворяют в 50 мл воды идобавляют 2,5 мл хлорной кислоты, На холоду выпадают белые кристаллы перхлората1,3-диметил-оксибен;эимидазолия, Выход 6,6 г(72,); т. ил. 172-173 оС (спирт). Спектр флуо.росценции (вода): Я макс возоуждения 303 нм, 25А макс флуоресценции 480 нм,5 г иерхлората 1,3 диметил 5.оксибензимидазолия в 70 мл уксусного ангидрида нагрева.кэт 2 час на водяной бане, раствор охлаждают ЗОиерхлорат 1,3-дилетил-ацетоксибензимидазо,ия(70 е); т. пл. 200-201 оС (очищают переосаждеием из уксусного ангидрида эфирам).Найдено," С 43,3; Н 4,3; С 11,3; М 9,4;11 Н 131(т 2 О 6Вычислено, о; С 43,2; Н 4,3; О 11,6; М 9,2,Спектр флуоресценции; Х макс возбуждения280 нм, А ,акс флуоресценции 340 нм,Предлагаемый субстрат 2 превосходит изве-стный субстрат 1 по устойчивости к спонтан., ному гидролизу, проводимому в течение 1 часпри 50 оС в буферном растворе (рН 7,5) при4 оисходной концентрации субстрата 1,10-4 М, чтовидно иэ следующих данных. количество гидроли оинного уо(трата 1 (:слнл:1 59;а гидролизовашого с;убстрата 219"11 р и м е р, Исполь кивание иредлагги могосубс:трата для определения каталитичс(:кой актини(эсти фермента - холинэстераэы,В термостатированную ири 25 оС кварцевуюкювету (толщина внутреннего слоя 1 см);ри.ливают и перелешиисют 0,6 мл фосфатвогобуферного ра(:твора (1,/15 М, рН 7,5), 0,3 мл1 М раствора хлористого калия, 0,3 мл рас;вора фермента - холинэстеразь и 1,5 мл исды (или водного раствора эффектора: акти.автора или ингибитора), Затем смесь инкуоируют в течение зада(аого времени и Добавляют 0,3 ллМ 10 11 раствора субстрата. Далее регистрируют скорость изменения флугресценции реакционной смеси, зависящую откаталитической активности холинэстераэь(По скорости холинэстеразного гидролиэасубстрат, 2 не уступает субс:трату 1 и арабо.тать с ним значительно удобнее и надежнее,Так, свежеприготовленный вод;ый раствор суб.страта 2 можно использовать в течение всегорабочего дня (не менее 8 час), а растворсубстрата 1 уже через 2-3 час не пригодендля точных измерений фе 1 л(ентатив 1 ой активности, Значительный сионтаиый гидролиэ субстрата 1 вызывает постояное монотонное изменение фона флуоресценции, что снижаетточность аналитического определения активнссти фермента,11 ерхлорат 1,3-диметил-б-ацетоксибензимидазо.лия Формулы