Способ получения иммобилизованной полинуклеотидфосфорилазы

ге ОП ИСАНИ ИЗОБРЕТЕНИЯ ти 1 4983 В Союз Советских Социалистических(51) М. Кл.- С 076 7/02 соединением заявки М Государственный комитет Совета Министров СССР 23) ПриоритетОпубликовано 05,01.76. Бюллетень хе 1 Дата опубликования описания 08.04,76(088,8) по делам изобретений и открытий(71) Заявители Кумарев, А, С. Райт Новосибирский госуд ециальное конструктбиологических а рствеиныи университетрско-технологическое бюктивных веществ ОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ПОЛ И НУКЛ ЕОТ ИДФОСФОР ИЛАЗЫ Изобретение относ ской и медицинской ности к получению ментов.Известен способ по ной полинуклеотидф валентного ее связы водонерастворимым нОднако активность этому способу по низкая и, кроме того ходимыми свойствами к микробно шленности,билизованнь гиче- част- ферится пром имм ия иммобилизова ил азы путем к с активированны лучен осфор вания оситеим линук, она мобилизованной по леотидфосфорилазы не обладает необДля достижения указаннои цели в качестве носителя используют силикагель, несущий активные остатки альдегида, присоединенные к носителю по связи кремний-углерод. Для стабилизации иммобилизованной таким образом полинуклеотидфосфорилазы ее обрабатывают восстанавливающим агентом, например боргидридом натрия в боратном буфере. Предварительно высокоочищенная иммобилизованная полинуклеотидфосфорилаза сохраняет 57 - 68% своей первоначальной активности, а ее использование в проточном колоночном варианте позволяет получить полинуклеотиды, не загрязненные примесями эндогенных нуклеиновых кислот.П р и м е р, 700 мг широкопористого микро- сферического силикагеля марки силохром В. К, Райт и В, В. Хомо С, содержащего 34 мк экв/г активных остатков пропионового альдепида, заливают 0,1 М боратным буфером и подвергают тщательной дезаэрации под вакуумом. После это го силикагель загружают в колонку(5 Х 0,6 см) и промывают боратным буфером. 4,5 мл раствора полинуклеотидфосфорилазы в боратном буфере (всего 69 мг белка) многократно пропускают через колонку О с силикагелем в течение 1,5 час при 4 - 6 Сдо прекращения изменения концентрации белка в растворе. Для удаления с поверхности силикагеля нековалентно связанного белка колонку промывают 0,5 М раствором 1 чаС 1 5 в боратном буфере и затем боратным буфером, Образовавшуюся между белком и альдегидными группами силикагеля связь стабилизируют восстановлением, пропустив через колонку 15 мл раствора боргидрида натрия О (1 мг/мл) в боратном буфере. После этого силикагель удаляют из колонки, промывают на стеклянном фильтре охлажденным боратным буфером, подвергают дезаэрации под вакуумом и вновь загружают в колонку для ис пользования пммобилизованной полинуклеотидфосфорилазы в реакции полимеризацпи рибонуклеозиддифосфатов.Количество белка, ковалентно связавшегося с силикагелем, рассчитывают по балансу О между исходным и несвязавшимся белком,498315 рывного использования в реакции полимеризации упри рН реакционной смеси 8,0) составляет 25 суток.Формула изобретения1. Способ получения иммобилизованной полинуклеотидфосфорилазы путем ковалентного ее связывания с активированным водо- нерастворимым носителем, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью увеличения активности иммобилизованной полинуклеотидфосфорилазы и придания ей необходимых технологических свойств, в качестве носителя используют силикагель, несущий активные остатки альдегида, присоединенные к носителю по связи кремний-углерод.2, Способ по п. 2, отличающийся тем, что, с целью стабилизации иммобилизованной полинуклеотидфосфорилазы, ее обрабатывают восстанавливающим агентом, например боргидридом натрия в боратном буфере. Составитель С, БеляевТехред 3. Тараненко Корректор Л. Денискина Редактор Е, Меньшова Заказ 47/3 Изд. Ув 78 ЦНИИПИ Государственного комитета по делам изобретений и Москва, Ж.35, РаушскаяТипография, пр. Сапунова, 2 определенным по методу Лоури. Для определения активности инкубируют прн 37 С 1 мл реакционной смеси, содержащей в мк-моль: АДФ 25; трис 100; Мд (СНзСОО)2 10 (рН 8,0) и водорастворимую или иммобилизованную полинуклеотидфосфорилазу. За единицу активности принимают такое количество фермента в препарате, которое в вышеуказанных условиях за 10 мин катализирует превращение 1 мк моль АДФ в полимер. Таким образом, с 1 г силикагеля связывается ковалентно 41 - 51 мг белка (1,2 - 1,5 мг белка на мк-экв, альдегидных групп), содержащего бб - 120 единиц активности (1,9 - 3,5 единиц активности на мк экв альдегидных групп). Иммобилизованная пол инуклеотидфосфорил аза полностью сохраняет активность в течение месяца при 4 - бС. Период полужизни иммобилизованного фермента в процессе непреТираж 576 ПодписноеСовета Министров СССРоткрытийнаб., д. 4/5