Способ получения гемпептида цитохрома с

)Об) АВ олдскоз саиде Гельство СССг(л);41.СьН; С,:ло ло". (10 ц 48 ИЯ8(и Со двр(хащлк ПЕ);1(д В (И 10 ОЗ(,4 З С 3 акгКЧав Ю ГСЯ В Т";)лтицЕСКСгцл(4 ДООЛИ 38 пред,:зри;ельно очищенно;о цлтохромз С и последуо;це( =ыделен (л Гемпептидз с пом 01 Цью ионообмен ной х)зоматОГрафии. Гел ьфи/ьГПЗ,)ии или иных методов (,1. 2)1 б, Р -; - , ЗКИМ К Г)рЕДЛЗГЗЕМому Яв 1 Яе ся "пособ (".О,1 учРниЯ ГемнонзпептиДЗ фгрзгглеьта 1/1 "2 Вкл)о )аощий в себя фермента(глвное рзс,е 1 ле;ие цитохоома С в, БО , 1768613 А 1 хроматографическая очистка гемпептида цитохоомзс гОслдук;щей е 0 л., фил 13 ЗЦией ГергДС: ерз иейобрзб 01 ки,рг)пс, Ром и(схОДЧОГО Г 1 рОДукта на ОсчОБР Ци 10 хома С;13 ВОДНО( О РЗСТВОРЗ С ког 4 ЦЕНТ РЗ Цие 1,О 1 .(МГ; мл цитсх)эома . 8 ГО Осаждают Воды)и раствором содержагдим О 1 - О, в 1 солл рехва лентного железа и О З-О б г. Иод)1 Со о НатРИЯ. ПОИ ЗТОМ ИСПОЛЬЗУ(С СООтчО(ЕНИЕРЗСтвОРа Ь 1 ТОХРОМ . И РаСТВОРЗ У аЗЗ 4 г.солей в интервале )1 О,.То позволяет(ЛГ ГОЛЬЗГ ВаЬ В З 48 г . 1.,(О. 40 Г( ( . СДл 8 П РОДО/1)К)ЛТ( Л ЬЫР 1 Р" "РГЦ(К= 01 ог ГГГ По ПОЛУЧЕНИЮ Чи.0(,. .,), ( Ох Р КЛС., : ТЗКЖЕ УпРО(ст,ТЬ ХРСМЗ(ОГОафцЕСКОЕ ВЫДС. ление целевого продукта и тем самым суще- СТВ 8 ННО 1 гПРОС 1 ИТЬ ЕХНСЛОГ.( РГ")( П",ОЦЕГ,; Г олучения гемгепт до) цито; Ос 18водном( О.: н )раствс ре "; н г е 0 и )з)л ВР,.О во( СООТ)40(ЕЧ 1 И 1ИПСИНЗ И Ц 1 ТСХОО( З 1 ( О.( к( ТЗМПЕЭЗТуОР 4С. ДВ(ХСЗЛИ 1 НлЬ ХОР "3- Тограф.1 ЧескуС 0 (11 СТКу Цел(РЗС;(3 );О" (Г (;( На КОЛОКР С Ка, )10 ЧИТ "За 8(К; ЧЗ,О (Г(н:.,се 11 ЗД соЯ и и Г 1 след(к Цк 3 1 фл (з0)ЛЮ ) ). ЬЫХОД ЦЕ ;ВОГР ГР(ЗДг 4 ГО 1,: Чл(".Ов И )1 РОТОИ 13:13 ЯЛС . - -(",- - П".высоко оч)щенного цгта ро,":3ЬО 1 ГЗ 3 Рк 0 )3.ляется упрощение про ясса пол,СОДРРЖЗЩИХ ПЕП г 10 ЬОС" ЗВ 1 ЕЧ -3 - цглч ДОГ.З В ,Л 1 ВРСОГл ГЮОГ 1( Ц,И (" (дов цитохрома С, включающем операции обработки трипси 1 ном исходно-О продукта на основе цитохрома С с ,Оследующей его лиофилизацией, перед операцией обработки трипсином исходного продукта на основе цитохрома С проводят осаждение цитохрома С из водного раствора с концентрацией 1,0 - 1,2 мг/мл водным раствором, содержащим 0,1 - 0,2 М сопи трехвален гного железа и 0,3 - 0,6 М иодистого натрия при этом используют соотношение раствора цитохрома С и раствора указанных солей в интервале (1 0-12) 1Уменьшение концентрации цитохрома С в растворе приводит к уменьшению выхода целевого продукта, а ее верхнее предельное значение 1 2 мг/мл обусловлено технологией г ри гото зле н ия исходного и родукта - экстрактов из тканейПрименение указанных выше пределов концентраций солей обусловлено тем, что меньшее котичество осадителя как при изменении концентрации в растворе, так и при использовании иных соотношений растворов цитохрома С из раствора, а при увеличени 1 л сверх предельных значений) количества солей происходит неэффективный расход примененных веществ без соответствующего повышения выхода целевого продукта,П р ие - 1. 0,6 л к 1 еточнсго экстоак;а Дрожжей о с 1 гаьенного итохромом С за счет уль графил ьтрации до концентрации ,0 мг/мл, под,исляют ДО р4,5, и выпавшие в осадок негемоаые белки отделяют центрифугированием . налосадоной жидкости доба 1 сляют 50 мл раствора содержащего 0,1 М сульфата железа ) и ".,3 У иодида натрия, Смесь выдеривают 20 мин при -4 С, отделяют осадок центрифугированием промывают водой для удаления остатка СО- лей. Осадок суспензируют с 25 мл 0 1 М раствора гидрокарбоната а 1 лмониЯ рН 8,45 л добавляот 6 МГ трипсина и проводя" гидролиз осадка при температуре 37" С в течение 4 ч Полученный красно-бурый раствор отделяют центрифуг 1 лоованием. раз бавляют 20 мл дистиллированно 1 л водь, и наносят на колонку,3,0:20) см с Амберлитом КСв Нформе, рН 5 6-6,0 Колонку промываот дистиллированНой водой ГемсОДеэжа щи Й пептиД с мы ва От 1 % раст вором гидроксида аммония, за; ем лиофилизуют, Выход гемпептида составляет 87 мг. Анализ гемпептида с помощьюСХ в системе н-бутанол вода уксусная кислота (4:1:5), электрофорет 1 лческим методом 1 л путем аминокислотного анализа показал соответствие полученного продукта гем-содержащему пептиду, выделенному из цитохрома С дрожжей известными способа ми и дал значение чистоты 89%П р и м е р 2, К 0,2 л экстракта цитохрома С из сердца крупного рогатого скота с концентрацией 1,2 мг/мл добавляют 20 мл раствора, содержащего 0 1 Ы сульфата же лезаи 0,4 М иодида натрия выдерживают раствор при +4 С и отделяю: осадок центрифугированием. Полученный осадок суспензируют в 10 мл 0.1 М раствора гидрокарбоната аммония. 1 рипсинолиз и очистку 15 проводят, как в примере 1, После лиофилизации получено 22 мг гемнонапеп 1 ида 14- 22 с чистоЮ 92%, по своим свойствам соответствующего гемнонапептиду цитохрочйС, полученному Г 1 О способу-прототипу, 20 П р 1 л м е р 3. К 0.2 л эксгакгра цигохромаС из сердца круп ного рога 1 ОГО скота: конценграцией , 2 мг/мл добавля 1 ог 20 мл оэствора.содерас,его 0,2 М хлорида железаи 0 6 М иодида натрия. врез 20 мин осадок отде ляют центрифугированием и провопят обработку, как в примеое 2 После очистки на колонке сАмберлитом ВСгемнонапептид концентрируют лиофильным высушиванием и ПРОВОДЯТ ДОПОЛНИ ГЕЛЬНУЮ ОЧИСскс С 10- мо 1 цью ГЕль-филетОации на с,в)аде, е Св 1 /о ном рас 1 воре Лдроксс 1 ва асм ния, Зь 1- .Од составил 19 мг 1;" 1-1 Онапептида 114 22 с ;истотои 96%РЕДлагаЕМ 1 зИ СЛОГ ПП 1; , 1 Ек ИЯ ГЕ 3 О ПЕГ 1 тидсВ цИГГХрома , 1 г:;1 ПпяГ Г, ЭГЬЭЭЭКСтраКтЫ тКаНЕй, 1 то 1 СКЛ оч Е .,;,с, и 1, ОС 1, я 1 ИЕ, Гродол,1 Е,Ь 111 ЯЕ И1) ,Г 1 с;,ИЕ ОГЕ- ра 1 и 1 ГО получению чис1;1 ци, ма С 40 Гакже упрости 1 ь;схнологический 1 Г 1 це, -пол р 1 ен 1 я е,пе 11 тидов цг 1 Ох 1 О.1 а . О О р мл а 1:1 3 0 б с е т е н и ЯСпособ и Ол у ч е ь и я Г ГГ к Г а и т 1 д а45 :а С, включающий Обоабоку цигохрома Стрипсином, хрома 1 ографическую Очисткус 1 е 11 О продукта с после 1 уоцеи ли 11 иЗаЦИЕИ ОТЛИЧаГОЩИЙСЯ св 1 Ч 10 Сцег 1 ью упрощения способа, обрабо кг 1 р и 50 сином подвергают цитохром С оса 11:ден ый-:1 ДГым раствором содержащи0О 2 Мсоли трехвалентного хелеза л .: 0 О г 1иодистого нария из экс 1 ракта при,:Одногоисточника цитохрома С с концентрацией по 55 следнего 1,0 -1 2 мг/м" экс 1 рак- ри Об;. -ЕМНОМ СООТН ОШЕН ИИ,1 КС Г Рс 1 КТа 1 :ОДНОГОрастпора солей Г 10-12) 1