Способ выделения свободного рибонуклеопротеида вирусов гриппа типов а и в

. М 1усологии И,ИвановГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ,8)2, ч.10, с.680-697.ч,39, с,250-259.ч,73, с,327-338.ДЕЛЕНИЯ СВОБОДНО РОТЕИДА ВИРУСО АИВ Изобретение относится к биологии, а именно к вирусологии,Известен способ выделения рибонуклеопротеида (РНП) вирусов гриппа путем разрушения вирионов смесью неионного и ионного детергентов с последующим седиментационным выделением вирионного РНП,Наиболее близким к изобретению является способ выделения РНП вирусов гриппа, предусматривающий обработку вирионов неионным детергентом (нонидет Р(Н Р), тритон М(ТН), лиэолецитин и др.) в гипертонической среде (0,25 М МаС) с нейтральным рН в диапазоне 7,4 - 8,1 с последующим выделением РНП посредством центрифугирования.Однако известные способы не позволяют добиться полной диссоциации вирионного РНП и матриксного белка М 1, что обусловливает невысокий выход свободного(без белка М 1) РНП. В указанных работах(57) Изобретение относится к области биологии, а именно к вирусологии. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта. Способ заключается в разрушении вирионов ортомиксовирусов, которое проводят в ходе их центрифугирования через раствор глицерина неионным детергентом в кислой среде с рН 6,0 - 4,5, Кислый рН обуславливает эффективную солюбилиэацию матриксного белка М 1, что позволяет осуществить близкий к 1000 ь выход вирионного РНП. удается получать около 20(, РНП от общего его количества в исходном вирусе - источнике выделения,Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта.Для этого разрушение вирионов вируса гриппа, которое происходит в ходе центрифугирования вирионов через раствор глицерина (так называемая совмещенная с центрифугированием депротенизация вирионов), осуществляют неионным детергентом в кислой среде с рН 6,0 - 4,5 в гипо- либо изотонических условиях (40 - 150 мМ МаС или КС 1), Кислый рН обусловливает эффективную солюбилиэацию белка М 1. что позволяет осуществить близкий к 100 выход свободного вирионного РНП.П р и м е р. 9-дневные куриные эмбрионы заражают вирусами гриппа А (О/ЯМ) 33 (Н 1 И 1)А/АсЬ 2/68 (НЗМ 2), А/РР Ч/И/еуогб 9 е(Н 7 М 7)В/ее/40 и СУлан-Уде/131/25/86 с множественностьюоколо 10 БОЕ на эмбрион и инкубируют при 33 - 36 С. Через 24 - 72 ч собирают вирусосодержащую аллантоисную жидкость (а.ж.), которую осветляют центрифугированием при 12000 об/мин в течение 20 мин (2 раза). Осветленную а,ж, разводят раствором Хенкса до 64 ГАЕ/мл и 8,5 мл полученной суспензии наслаивают ня двухступенчатый градиент глицерина; 3,8 мл 15-ного раствора, приготовленного на воде (интерслой), и 4,3 мл 256-ного раствора (базовый слой), содержащего 1 НРили ТН, йаС 40 мМ ингибитор протеиназ-апротинин для предотвращения деградации вирусных белков и 10 мМ трис-гидроксиметиламинометана, который доводят до значения рН = 5,0, гидро ксиэтилпиперазинзтансульфоновой кислотой (трис-ГЭПЭС-буфер), либо морфолиноэтансульфоновой кислотой (трис-МЭС- буфер). 15-ный интерслой служит для концентрации вирионов и предотвращает соприкосновение вирусосодержащей а,ж. с содержащим детергент базовым слоем.Сформированные градиенты центрифугируют при 22 000 об/мин в течение 2,5 ч при 11 - 12 С(ротор ЯИl 27.1; Ярпро5-65). Г 1 ри центрифугировании вирионы проходят интерслой и входят в базовый слой, где подвергаются воздействию детергента в среде с рН 5,0, Детергент растворяет липопротеидную оболочку вируса, что вызывает освобождение оболоченных вирусных белков, НА 1, НА 2, и М 1, которые после растворения остаются в растворе глицерина в силе невысокой скорости седиментации, а вирусные нуклеоиды (РНП с белком М 1) или свободные РНП проходят 25 фглицерин и осаждаются на дно центрифужной пробирки. После центрифугирования надосадочную жидкость аккуратно удаляют. Белки осадков (нуклеокапсидная фракция) растворяют в буфере (1 додецилсульфата натрия, 0,01 М дитиотреита, 0,2 М трис-НС, рН 6-8) в течение 1 - 2 мин в кипящей водяной бане и анализируют с помощью злектрофореза в полиакриламидном геле. По данным полипептидного анализа осадков судят о степени депротеинизации вирионов,Электрофореэ белков проводят в пластинах (толщина 1,2 мм), Разделительный гель (10 см) - трис-НС-буфер (рН 8.8), фокусирующий гель (1 см)-трис-НС-буфер (рН 6,8), Система полимеризации - рибофлавин 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50(8 мкгр/мл)-1 ЕМЕД (0,04 ) при облучении УФ-светом, После злектрофореза гели окрашивают Кумаси В(РЬагааса). Для количественной оценки белков окрашенные гели сканируют в видимом свете на микроденситометре СОЯ(ВесЕпап),Количественная оценка результатов, выполненная на основании сканирования гелей, показывает, что в нуклеокапсидной фракции белок М 1 сохраняется в количествах не более 5 6. Сканирование также показывает, что содержание главного нуклеокапсидного белка чР во фракции, изолированной при кислых рН, было сходным с таковым в препарате исходного вируса, Такой результат говорит о практически полной изоляции РНП из вируса с помощью данного способа выделения.Характеристику вирусных РНП, выделенных при кислых рН предлагаемым способом, проводят электронно-микроскопическим исследованием нуклеокапсидных осадков. Оно показывает, что в препаратах, выделенных при кислом рН 6,0 - 4,5, обнаруживаюттипичные спиралевидные сегменты вирусного РНП.Таким образом, представленные результаты демонстрируют, что разрушение вирионов вируса гриппа типов А и В с помощью неионного детергента в среде с рН 6,0 - 4,5 позволяет с высокой эффективностью диссоциировать РНП от поверхностных гликопротеидов и матриксного белка М 1, что, с свою очередь, позволяет с помощью центрифугирования добиться практически полной изоляции вирионного рибонуклеопротеида из исходного вирусного препарата, что говорит о повышении выхода целевого продукта.Формула изобретения Способ выделения свободного рибонуклеопротеида вирусов гриппа типов А и В путем разрушения наружной оболочки вирусных вирионов неионным детергентом, фракционирования в градиенте концентрации глицерина, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, разрушение наружной оболочки вирусных вирионов осуществляют непосредственно при фракционировании, а раствор глицерина готовят на 5 - 25 мМ буфере трис-ГЭПЭС или трис-МЭС, рН 4,5 - 6,0, содержащем 40 - 150 мМ ИаС,