Способ выделения из воды вирусов

(19) 111) СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 1 0 1)5 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ БТОРСКОМУ С 8 ЛЬСТВ Извест патита А и мов сто включающ ние вир и ультра ключите вируса геьших объей воды, нтрироваа бетоните ата на заен способ выделения энтеровирусов из бол ной и прирадно й двухэтапное конц в методом сорбции н нтрифугирование. элю ом этапе,усо це ль способа является эффективности от ды взвешенными ьшая длительность оформление метоенение в лабораДостоинством этого малая зависимость его степени загрязнения во веществами, Однако бол и сложное аппаратурное да затрудняют его прим торной практике. ГОСУДАР СТВЕ ННЫ Й КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР 1(71) Ленинградский политехнический институт им. М,И, Калинина, Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР и Государстве н н ы й науч но-исследовател ьский и проектный институт по обогащению . руд цветных металлов "Казмеханобр" (72) Г,А. Ширман, В.М. Коликов, В,А, Гиневская, В.А. Казанцева, Л.Е. Баева, О.Е, Иванова, Т,П. Еремеева, А.Б. Орешков, Н.В. Катушкина, П.С. Григорьев и Н,Я, Любман (53) 578(088,8)(56) Красильников И.В Каранцева В,А., Иванова О,Е. и др. Выделение вирусов из воды с использованием пористых кремнеземов. Вопросы вирусол. 1985, т. 30, М 5, с.608.Йар 1)ае В.АЯаааг Я.А., Ярг п 91 Ьогрег Ч.Я. Врачгаз сопсеп 1 га 11 оп агап) гав аа 1 ег 081 п 9 рог 111 чеу с 1)агцеб 11 тегз О.1. ч 1 го 1, Мей,- 1985, - ч. 11 - й 2 - р. 131-140. Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для извлечения неопределимо малых количеств вирусов из больших объемов воды и их концентрирования до уровня чувствительности вирусологических методов при осуществлении контроля за степенью зараженности вирусами водных объектов окружающей среды,Известен метод выделения вирусов путем удаления воды из пробы через диализную мембрану с полиэтиленгликоль (гидроэкстракция), Однако этот метод можно использовать лишь при работе с малыми. объемами.(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ИЗ ВОДЫ ВИРУСОВ(57) Способ выделения из воды вирусов. Использование: извлечение неопределимо малых количеств вирусов из больших объемов воды и их концентрирования до уровня чувствительности вирусологических методов. Сущность изобретения: анализируемую пробу пропускают через фильтр-адсорбент, представляющий собой пространственноглобулярную структуру из меламиноформальдегидной смолы с проницаемостью материала 1000 уд. об./ч, Сорбированный вирус элюируют буферным раствором, содержащим 0,5 - 1,0 моль М йаС 1, 3,0 - 3,5 мясного экстракта и имеющим рН 7,5,20 25 30 35 Известен способ выделения вирусов иэ воды с использованием пористых кремнеземов.К недостаткам этого способа относятся невысокая скорость обработки воды и низкий фактор концентрирования,Наиболее близким к предлагаемому является способ выделения вирусов из воды путем их сорбции на положительно заряженных фильтрах Уе 1 а Р 1 цэ 303 с последующей элюацией 3%-ным мясным экстрактом и рН 9,0, Этот способ имеет следующие недостатки;- низкий фактор концентрирования (2,5 - 4,5 раза) и малая эффективность открытия 14,1 +4,1)%),- достигнутого фактора концентрирования оказывается недостаточно для анализа и приходится прибегать к гидроэкстракции с полиэтиленгликолем, занимающей порядка 8 ч (ночь).Цель изобретения заключается в повышении производительности процесса и увеличении фактора концентрирования вируса.Поставленная цель достигается тем, что анализируемую воду пропускают через фильтр-адсорбент, представляющий собой пространственно-глобулярную структуоу (ПГС) из меламиноформальдегидной смолы с проницаемостью материала 1000 уд.об,/ч. (Удельный объем (уд, об.) - безразмерная величина, численно равная объему пропущенного фильтрата, отнесенному к обьему адсорбента. Проницаемость материала измерялась в уд. об,/ч и определялась, как количество уд, об., пропущенных за 1 ч через слой адсорбента толщиной 0,5 см при давлении 0,1 атм (1 м вод, ст.), Сорбированный вирус элюируют буферным раствором, содержащим 0,5 - 1,0 моль МаС 1, 3,0 - 3,5% мясного экстракта и имеющим рН 7,5.Сущность изобретения заключается в выборе адсорбента, обеспечивающего быстрое и эффективное выделение вирусов из воды, и в условиях десорбции вирусов,Структура адсорбента получается путем коагуляции полимерной фазы.в растворе в статических условиях в герметичной форме с последующей фиксацией двухфазной системы термообработки. Положительный эффект изобретения определяется большой внутренней поверхностью адсорбента, доступной для взаимодействия с- вирионами, и незначительным гидродинамическим сопротивлением материала адсорбента. При выборе оптимальных условий элюции вирусов учитывают необходимость устранения электростатических и гидрофобйых взаимодействий, возникающих между вирусной частицей и внутренней поверхностью фильтра-адсорбента.В качестве примеров рассматривают процессы выделения вирусов из воды,П р и м е р 1 (по прототипу). Ротавирус человека И подгруппы вносят в 250 мл воды, создавая концентрацию 1,3 10 1/мл. Пол 4ученную воду пропускают через фильтр Уела Роэ ЗОЯ (с размером пор 2 мкм) диаметром 47 мм. Во всех пробах фильтрата вирус не выявлялся, адсорбция вируса 100%, Для элюции вируса используют 3.%-ный мясной экстракт с рН 9,0, Отбирают 10 мл элюата. Концентрация вируса в элюате (4,6 + 1,3) 10 1/мл, Таким образом, фактор концентрирования в данном случае составил всего 2,5 - 4,5 раза, а эффективность открытия -(14,1 4,1)%. Из-за низкого фактора концентрирования приходится прибегать к гидроэкстракции с полиэтиленгликолем, занимающей порядка 8 ч (ночь),П р и м е р 2 (по предлагаемому способу), Ротавирус обезьян ЯА - 11 осветляют центрифугированием при 2000 об/мин в течение 10 мин и добавляют в воду, содержащую 0,005 моль М 9 С 12, создавая концентрацию 118 АГед/мл (по данным иммуноферментного анализа, По 3 л такой воды пропускают через фильтр-адсорбент с проницаемостью материала 1000 уд. об./ч, выполненный в виде таблетки диаметром 1,7 см и толщиной 0,5 см (обьемом чуть более 1 мл с площадью поверхности 2,3 см ), Скорость пропускания воды 30 мл/мин (1700 уд,об,/ч). Во всех пробах фильтрата вирус не выявлялся, адсорбция вируса 100%.Для элюции вируса с фильтра-адсорбента используют девять различных буферных растворов, содержащих 0,05 моль трис-НС 1;0,5, 0,7 или 1,0 моль ИаС 1; З,О, 3,2 или 3;5% мясного экстракта (Вее 1 ехтгасс, ОИсо) и имеющих рН 7,5, Элюат отбирают по 15 - 20 мл. Определяя всякий раз концентрацию вируса в исходном образце и в элюате, вычисляют фактор концентрирования и эффективность открытия вируса. Результаты представлены в таблице,В данном случае эффективность открытия менялась от опыта к опыту в диапазоне 60 - 70% (погрешность определения порядка 10%), а фактор концентрирования - в диапазоне 680 - 700 раз. Таким образом, можно говорить о слабой зависимости этих важных характеристик процесса выделения от концентрации МаС и мясного экстракта в заявляемом диапазоне, Всякий раз операция выделения занимала 1 ч 45 мин.1742333 Влияние злюента на процесс выделения вируса ЯАиз воды спомощью ПГС-адсорбента из меламиноформальдегидной смолы Составитель И.АгафоноваТехред М.Моргентал Корректор А. Осауленко ванов едакт аказ 2262 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СС 113035, Москва,.Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 П р и м е р 3 (по предлагаемому способу).Вирус полиомелита типа 1, штаммЗс 2 аЬ осветляют центрифугированием при 2000 об/мин втечение 10 мин идобав ляют в воду, содержащую 0,005 моль МдС 12, создавая концентрацию 8,3 10 БОЕ /мл, определяемую титрованием на культуре клеток почек американских зеленых мартышек. 1 л такой воды пропускают через 10 фильтр-адсорбент, выполненный.в виде таблетки диаметром 1,7 см и толщиной 0,5 см. Скорость пропускания воды 30 мл/мин (1700.уд.об./ч). Для элюции вируса с фильт-. ра-адсорбента используют буферный рас твор, как в примере 2.В данном случае фактор концентрирования 168 раз, а эффективность открытия - 27,7%, Вся операция заняла 34 мин.Использование предлагаемого способа 20 выделения из воды вирусов обеспечивает по сравнению с существующими способами следующие преимущества:- высокие скорости обработки воды, что существенно увеличивает производитель- .25 ность процесса (не менее чем. в 4 раза по сравнению с прототипом);- высокий фактор концентрирования вируса (до 700 раз, что в 150 раз больше по сравнению с концентрированием на фильтрах Леса Р 1 из),Использование изобретения возможно в лабораторной практике санитарно-эпидемиологических станций и подобных учреждений при осуществлении контроля за степенью зараженности вирусами водных объектов окружающей среды,Влияние элюента на процесс выделения вируса ЯА-из водйс помощью ПГС-адсорбента из меламиноформальдегидной смолы,Формула изобретения Способ выделения из воды вирусов путем их сорбции на поверхности адсорбента с последующей элюцией, о т л и ч а ю щ и й-. с я тем, что, с целью повышения производительности и роцесса и степени концентрации вируса, в качестве адсорбента используют меламиноформальдегидную смолу с проницаемостью материала 1000 уд. об./ч,.а элюцию осуществляют буферным раствором рН 7,5, содержащим 0,5-1,0 моль йаС и 3,0 - 3,5 мясного экстракта.