Штамм бактерий bacillus cereus продуцент эндонуклеазы все 751 1

(51)5 С 12 И 9/22 1/20 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН уклеоти- В.сегецв иологии и предпродуцируюций , используемую учения ирагменмолекул ДНК орных молекул логии и молекулярставляет собой штэндонукпеазу Всекак инструмент длятов ДНК, картирови конструирования по век ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Всесоюзньо 1 научно-исследовательский институт прикладной микробиологиии Институт микробиологии и вирусологииАН УССР(56) РоЬеггя К.1, Реягсгоп епкутеяапй СЬе 1 г 1 яояЬ 1.яогпегя. 11 щ 1., АсЫя.Рея. ч, 16, Бесцепсе Вцрр 1. р 271313, 1988.(57) Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии, Целью Изобретение относится к биотехноДо настояцего времени не обнаружено среди вида Вас 111 ця сегеця штамма, продуцируюцего эндонуклеазу, способную узнавать на ДНК последовательность 5 ССАТССЗ .Цель изобретения - получение штамма В. сегеця ВКПИ В(751 1), про дуцируюцего сайт-специфическую эндонуклеазу Все 751 1, способную узнавать,.901645299 изобретения является получение штамма В сегеця ВКП 11 В(751 1), продуцируюцего сайт-специфическую эндонуклеазу Все 751 1, способную узнавать на ДНК последовательность нуклеотидов 5 ССАТССЗ. Для получения биомассы культуру засевают в колбу объемом 3 л, содержащую 700 мл среды, содержацей, г/л воды: дрожжевой экстракт 5, триптон 5, натрий хлористый 5, и инкубируют в условиях качалки до средней логарифмической Фазы, затем клетки отделяют центрифугированием при 10000 8. Выход Фермента 10000 ед/г биомассы. Активность эндонуклеазы определяют по гидролизу ДНК Фага, продукты реакции анализируют электроФорезом в геле 0,8 Х-ной агароэы. на ДНК последовательность и дов 5 ССАТСС 3 . Отамм выделен из почвы и характеризуется следувцими признаками.ИорФологические признаки. Прямые палочки, размер клеток 18 часовой культуры 3,5 х 1,1 мкм, Клетки располагаются одиночно или цепочкой. Эллипсовидные споры располагаются в клетке центрально, Клетки при спорообразовании не раздуваются.Культуральные признаки. На твердом мясопепетонном агаре через 18 чороста при 37 С образуются колонии молочного цвета со слегка волнистым краем, Образование спор начинается через 48-72 ч при вырацивании на1645299 Формула изобретенияПтамм бактерий Вас 111 цз сегеозВКПИ В- продуцент эндонуклеазыВсе 751 1,1Составитель И. ПриваловаТехред М.Дндык Корректор М. Шарошн Редактор С. Лисина Заказ 1.322 Тираж 377 ПодписноеВНИИЛИ Государственного комитета по нзоьретениям н открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул, Гагарина, 101 мясопептонном агаре при 37 С. После роста на глюкозном агаре в протоплазме обнаруживаются глобулы. Рост на жидкой питательной среде характеризуется равномерньв помутнением.физиолого-биохимические признаки. Грамположительные аэробные спорообразуюцие палочки. Продуцируют ката- лазу. Культура Ферментирует глюкозу, 10 арабинозу, маннит с образованием кислоты, ксилоэу не использует. Утилизирует цитрат и пропионат, гидролизует крахмал, в анаэробных условиях из нитратов газ не образует, дает 15 положительную реакцию Фогес-Проскауэра, обеспечивает метиленовую синь, Растет в анаэробных условиях.Ытамм продуцирует сайт-специфическую эндонуклеазу Все 751 1, узнающую на дйухнитевой .ДНК последовательность нуклеотидов 5 ССАТССЗП р и м е р. Получение сайт-специФической эндонуклеазы Все 151 1.штамм В. сегеиз 751 хранится в 15 пробирках на агаризованной среде под вазелиновым маслом. Для оживления культуру пересевают на скошенный мясопептонный агари инкубируют в термостате при 37 С в течение 24-36 ч. Для 30 получения биомассы культуру засевают в колбу объемом 3 л, содержащую 700 мл среды, содержащей, г/л, дрожжевой экстракт 5; триптон 5; натрий хлористый 5 и инкубируют в условиях качалки до средней логарифмической Фазы, за-,35 тем клетки отделяют центрифугированием при 10000 . 0,5 г клеток суспендируют в 0,5 млбуфера А (0,2 И НаС 1; 0,01 И К-Фосфат; рН 7,0; 2 мИ дитиотрейтол;0,1 мИ ЭДТА) разрушают ультразвукомпри охЛаждении льдом, клеточные стенки осаждают при 40000 я. Надосадочнуюжидкость хроматографируют на колонке1,5 х 30 см с Тоуореаг 1 Б 4-55, уравновешенной в том же буфере со скоростью20 мл/ч, фракции 0,8 мл. Активностьэндонуклеазы определяют по гндролизуДНК Фага ф , продукты реакции анализируют электрофорезом в геле 0,83-нойагарозы. Фракции, содержащие эндонуклеазу, объединяют, диалиэуют против буфера А, содержащего 507 глицерин и хранят при -20 С, Выход Фермента 10 тыс. ед/г биомассы,Специфичность эидонуклеазыВсе 751 1 определяли по гндролизуею различных ДНК с известной первичной структурой (ДНК фагов 9 , И 13,фХ 174, плазмиды рВВ 322).Установлено физическим картированием, что эндонуклеаэа Все 751 1 узнает и гидролизует ДНК рВВ 322 и точках с координатами 375 п,о., ДНКФага-5505, 72346, 27972, 41732 п.оДНК ФХ 174 не гидролиэуется. Анализэтих данных приводит к заключению,что эндонуклеаза Все 751 1 узнаетпоследовательность нуклеотидов ССАТСС,