Способ количественного определения активности специфических эндонуклеаз-рестриктаз
Похожие патенты | МПК / Метки | Текст | Заявка | Код ссылки
Номер патента: 740824
Авторы: Вайткявичюс, Янулайтис
Текст
йИ е. Па ЧЕОИЯ Союз СоветскихСоцнаянстических к МБД(22) Заявле С 12 0 13 исоедине ем заявки М -твенныЯ комнтеСССРам нзобретеннЯоткрытиЯ осуд(23) Приори по дед но 15,06,80, Бюллете кования описания 15 Опублико 53) 77,15,088,8)ИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИЧЕСКИХ ЭНДОНУКЛЕАЭ-РЕСТРИКТАЭ онуклесл чае о н 0 Изобретение относится к микробиологической промьхнленности, в частности, к производству ферментов, и представляет собой. новый способ количественной оценки ферментативной активности эндонуклеаз-рестриктаз.Известен способ количественного определения активн 9 сти специфической эндонуклеазы-рестриктазы Есо Н 1 путем инкубации фермента с кольцевой меченой:. Р дезоксирибонуклеиновой кислотой вируса ЯЧв среде, содержащей минеральные соли и органические вещества, при постоянных температуре и рН. После завернения 15 инкубации исходный субстракт и продукты реакции разделяют методом электрофореза а агарозном геле. Количество продуктов реакции измеряют радиоизатопными методами 1, 20Недостатком способа является его трудоемкость, которая связана с применением электрофореза для отделения субстрата от продуктов реакции, а также с получением и последующим 2 использованием меченого Р радио 32 активного субстрата, что требует сложной и дорогостоящей специальной аппаратуры. Кроме того, данный способом определяют активность только 3 единственной конкретн й энд азы-рестриктазы, в да ном у Есо й 1.Наиболее близким по технической сущности к изобретению является способ количественного определения активности эндонуклеазы-рестриктазы Есо Н 1, заключающийся в ннкубации при постоянных температуре и рН фермента с кольцевой меченой Н дезоксирибонуклеиновой кислотой плаэмиды Со 11 Ес в буфере, содержащем дезоксирибонуклеазу гес ВС, минеральные соли и органические вещества. После завершения инкубации непрореагировавший субстрат осаждают трихлор,уксусной кислотой и отделяют от продуктов реакции центрифугированием. Количество продуктов реакции оценивают радиоизотопными методами 2,Однако и этот способ количественного определения активности эндонуклеазы-рестриктазы Есо Н 1 имеет существенные недостатки, связанные с применением радиоактивной плазмидной дезоксирибонуклеиновой кислоты, получение которой сопряжено со значительными трудностями, а последующее использование в работе требует специальной дорогостоящей аппаратуры и соблю740824 Оптическая плотность при 260 нм 0,211 0,207 0,220 0,226 0,072 0,070 Т а б л и ц а 2 Контр Есо 1 354 0,110,19 0 35 5 О 1 0 1 дения особых мер техники безопасности.Помимо этого, также как и в предыдущем случае, рассматриваемый способдает возможность определять активность только единственной эндонуклеазы-рестриктазы.Целью изобретения является упрощение и унификация процесса определения ферментативной активности.Поставленная цель достигаетсятем, что в качестве субстрата используют линейную дезоксирибонуклеиновую кислоту, иммобилизованную нацеллюлозе, а продукты реакции измеряют спектрофотометрически.Суть способа заключается в следующем, фермент инкубируют при постоянных температуре и рН с дезоксирибонуклеиновой кислотой, выделенной изклеток Е со 11 С 600 по методу Сантои Миура и иммобилизованной на целлюлозе марки Ватман ЦФ, в присутст- Явии минеральных солей и органическихвеществ. Реакцию останавливают добавлением ЭДТА с одновременным охлаждением инкубационной смеси, Активность эндонуклеаэ-рестриктаз определяют количеством дезоксирибонуклеиновой кислоты, отделившейся от целлюлозы под воздействием фермента. Количество свободной дезоксирибонуклеиновой кислоты - продукта реакции,определяют измерением оптической плот-ЗОности при 260 нм,Разработанный способ позволяет определить активность любых эндонуклеазрестриктаз, так как фрагменты дезоксирибонуклеиновой кислоты отделяютсяот целлюлозы под воздействием любыхендонуклеаэ-рестриктаз. Другое отличие состоит в том, что при опреде.лении ферментативной активности предложенным способом не требуется специальных помещений и служб, необходимых при работе с радиоактивнымису бстратами,П р и м е р 1. Определение активности эндонуклеаз-рестриктаэ Есо К 1и ЕСО Н 11 в очищенных препаратах.1 г субстрата - иммобилизованнойна целлюлозе дезоксирибонуклеиновойкислоты - суспендируют в 30 мл буФерной смеси 1 (0,1 М трис-НС 1-буфер,РН 7,5 р 0,05 М ИаС 1 у 0,01 М МдЯО 4),разливают по 1 мл в шесть центрифужных пробирок и добавляот по 3 млохлажденной до 4 С буферной смеси 1,содержащей дополнительно 0,05 тритонаХ. Суспензию осторожно перемещивают при помощи стеклянной палочки и центрифугируют при 4 фС 2 мин при500 об/мин. После окончания центрифугирования насадочную жидкость сливают. Центрифужные пробирки с субстратом помещают в ледяную баню. В две про бирки добавляют по 5 мкл очищенного препарата рестриктазы Есо В 1, в другие две - по 5 мкл очищенного препарата рестриктазы Есо В 11, а в ос тавшиеся пробирки, служащие контрольными, фермента не добавляют. Содержимое пробирок осторожно перемеаивают стеклянной палочкой и помещают в термостат на 15 мин при 37 ОС,После завершения инкубации пробирки помещают в ледяную баню и добавляют по 1,6 мл 2 мМ раствора трилона Б. Суспензию перемешивают и центрифугируют 5 мин при 3500 об/мин. Надосадочную жидкость переливают в кювету спектрофотометра Сфи измеряют оптическую плотность при 260 нм пРотив 2 мМ РаствоРа трилона Б,Результаты измерения приведены в табл1.Та блица 1 За условную единицу активности принимают количество эндонуклеазырестриктазы, которое за 15 мин инкубации при 37 ОС дает в опытной пробе по сравнению с контрольной прирост поглощения при 260. нм на одну оптическую единицу.Активность препарата эндонуклеазрестриктаэ рассчитывают из Разностей средних оптических плотностей опытных и контрольных проб и относят полученные результаты к 1 мл исследуемого препарата:0 220 + 0 226Есо В 1О 072 + О 070 О 0052О 211+0 257Есо Н 1120072 + О 070 О 00527,6 Е/млП р и м е р 2. Определение активности рестриктаэ Есо Н 1 и Есо Н 11 в неочищенных препаратах.Ход определения ферментативной активности такой же, как в примере 1, единственное отличие состоит в том, что после добавления трилона Б в контрольные пробы вносят по 5 мкл соответствующих препаратов эндонуклеаз-рестриктаз. Результаты представлены в табл2. Оптическая плотность при 260 нм740824 Формула изобретения Составитель Н,Паников Техред М,Кузьма Корре к тор В. БУ т яга Редактор Е,Хорина Заказ 3154/31 Тираж 522 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, %-35, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП Патент, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 Активности препаратов ферментов рассчитывают аналогично тому, как это было сделано в примере 1, и получают следующие результаты: активность эндонуклеаэы-рестриктаэы Есо й 1 21,8 Е/мл, активность эндонуклеазырестриктазы Есо 811 33,4 Е/мл.Предлагаемый способ позволяет, таким образом, количественно определить кактивность зндонуклеаз-рестрик таз в препаратах разной степени очистки. Для приготовления субстрата вместо дефицитной и дорогостоящей дезоксирибонуклеиновой кислоты, получаемой с исйользованием радиоактивных соединений и специальной сложной аппаратуры, применяют нерадиоактивную дезоксирибонуклеиновую кислоту, получаемую с,использованием дешевых реагентов и несложной аппаратуры. Применение иммобилизованного на целлюлозе универсального субстрата поз воляет предлагаемым способом проводить определение активности не только эндонуклеаэы-рестриктазы Есо Н 1, но и любых других эндонуклеаз рестриктазного типа действия. 25Простая аппаратура, дешевые реактивы, применяемые для количественного определения ферментативной активности, а также снижение трудоемкости позволит (по предварительным расчетамсэкономить около 4500 руб. в год при использовании предлагаемого способа . во ВНИИ прикладной энзимологии Главмикробиопрома СССР,Способ количественного определения активности специфических эндонуклеаз-рестриктаз, предусматривающийвведение препарата рестриктазы вбуфер, содержащий минеральные соли,органические вещества и субстрат,инкубирование реакционной смеси, отделение продуктов реакции от субстратаи измерение их количества, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цельюупрощения и унификации процесса, вкачестве субстрата используют линейную дезоксирибонуклеиновую кислоту,иммобилизованную на целлюлозе, апродукта реакции измеряют спектрофотометрически,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Р.1. Сгееп, Мейодз ойМо 1 есц 1 аг В 1 о 1 оду,1974,чо 1.7, р.872. Р. Мойг 1 сЬ, О.ЕаЪе 1, 1.В 1 о 1Сйев 1 згу, 1976, чо 1. 251, р. 58 бб 5874 (прототип) .
СмотретьЗаявка
2520258, 17.08.1977
ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПРИКЛАДНОЙ ЭНЗИМОЛОГИИ
ВАЙТКЯВИЧЮС ДОНАТАС ПОВИЛОВИЧ, ЯНУЛАЙТИС ЭУГЕНИЮС-АРВИДАС АНДРЕЕВИЧ
МПК / Метки
МПК: C12D 13/10
Метки: активности, количественного, специфических, эндонуклеаз-рестриктаз
Опубликовано: 15.06.1980
Код ссылки
<a href="https://patents.su/3-740824-sposob-kolichestvennogo-opredeleniya-aktivnosti-specificheskikh-ehndonukleaz-restriktaz.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ количественного определения активности специфических эндонуклеаз-рестриктаз</a>
Предыдущий патент: Способ сбраживания сусла при производстве спирта
Следующий патент: Способ стабилизации ферментных препаратов
Случайный патент: Устройство для получения высокого напряжения