Способ определения ротавирусных антигенов

.,901645298 А 1 О 1) С 12 И 7/00, С 01 И 33753 1к ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ А ЮТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 2ОПРЕДЕЛЕ 11 ИЯ РОТ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ(56) Горбачев Е.11. и др. Иммуноферментный анализ в диагностикеротавирусных гастроэнтеритов людей, Вопросы вирусологии, 1,986, 9 6, с, 743-746,ЯсйотаасЬег Вегпд г 11 г йадпозг 11 с чоп 1,огачдгцз 1 п 1 еЕ 1 чпеп: Уег 81 есЬ чоп й.гекгета спи пйегеЕгев Е 1.1 БА гни Мъгкдеппас 11 пекь, 1986, М 21, 1737- 1740. 1;. К 11 п, 21 ес 1. 1986, 11 21, 1737740. Изобретение относится к вирусологии и может найти применение при диагностике острых вирусных инфекций.Цель изобретения - упроцение мето-, да, повьвение чувствительности.Исследуемый материал наносят на мембранные фильтры отечественного производства, характериэувциеся равномер(54 ) СПОСОБ АВИРУСНЬИ АНТИГЕ НОВ(57) Изобретение относится к вирусологии и может найти применение при диагностике острых вирусных инфекций, Целью изобретения является упроцение метода, повыиение чувствительности. Для этого исследуемый материал наносят на мембранный фильтр с размером . пор 0,2-0,6 мкм, инкубируют в буферном растворе с бычьим сывороточным альбумином и на этом растворе выполняют разведения реагентов, этапы исследования осуществляют путем погружения фильтров в соответствуюцие растворы, в качестве Ферментной метки применяют антипероксндаэные ан 1 итела в комплексе с пероксидаэой, учет реакции производится визуально через 4-5 ч. Преииуцеством предлагаемого способа является упрощение, повышение результативности в 1,1-1,5 раза, сокраценне сроков исследования в 4,4-6 раз, снижение затрат на реагенты в 28 раз. 3 табл. ным распределением гидрофобных участков, обеспечивающие прочную фиксациюантигена за короткое время путемфизической адсорбцни и исключающиеколебания в количестве связываюцегося белка на разных участках носителя и потерю их на последующих этапах анализа. Проводят инкубацию сбычьим сывороточным альбумином и выполняют разведения всех реагентов на калий-калиевом Фосфатном буферном растворе с бычьим сывороточным альбумином, промывают Фильтры на всехэтапах анализа этим же буферным раствором с включением детергента - твин 20, что позволяет уменьшить не- специфическое связывание. Используют антипероксидазные антитела в комплексе с пероксидазой на стадии сформировавыегося комплекса антиген-антитело-антивидовое антитело приводящего к связыванию Фермента через антитела к Ферменту, что повыыает чувствительность способа. Осуществляют анализ по принципу погружения носителя в растворы.Основанием для выбора твердого носителя, состава буферного раствора для разведения реагентов и отмывки носителя, условий проведения этапов анализа, длительности стадий инкубации служат экспериментальные исследования, результаты которых представлены в таЬл, 1.Еак видно из представленных в таблице данных, мембранные фильтры Деснянского производства не уступают по сорбционной способности Фильтрам заруЬежного производства.Введение Ферментной метки типа антипероксидазных антител в комплексе с пероксидазой позволяет увеличить число положительных находок в исследуемом материале в 1,5 раза Ротавирусный антиген обнаруживают с одинаковой частотой при инкуЬации в течение 18 ч при 4 ОС и в условиях териостата - в течение 1-2 ч.Анализ приведенных данных свидетельствует также о целесообразности использования при осуществлении анализа 0,15-0,2 И калий-калиевого фосфатного Ьуфера рН 7,5, так как применение этого буфера позволяет обнаружить наибольшее число положительных проб.Суыественное значение оказывает и введение стадии инкубации твердого носителя в буферном растворе с 1,5- 2,0 Х бычьего сывороточного альбумина, повьплая процент обнаружения рота- вирусных антигенов в сравнении с данныии, когда эта стадия не вводится.В качестве исследуемого материала берут фекалии больных острыми кишечныии инъекциями в виде Фильтратов 10 Х5 1 О 15 20 25 30 35 40 45 50 55 суспенэии исходной пробы или неФильтрованных суспензий, собранныхне позднее пятого дня от начала заболевания и приготовленных по общепринятой методике,Способ осуществляется следующимобразом и состоит иэ двух этапов:подготовительного и основного,Подготовительный этап включает: определение размера Фильтра для проведения исследования, разметку и шифровку; размножение вирусов на культуреклеток с целью получения антигенов(положительный и отрицательный контроль); приготовление калий-калиевогоФосфатного буферного раствора и трисНС 1; приготовление необходимых разведений реагентов, используемых в анализе.В работу берутся мембранный фильтрМ 1 - Р 2 с размерами пор 0,2-0,6 рщДеснянского производства диаметром9,5 си при исследовании большого числа образцов одновременно (более 400)или часть его, либо число проб невелико. На глянцевой стороне Фильтрапростым карандашом обозначают номери ставят метку в виде точки (или черточки), указывающей порядок нанесенияисследуемых проб.На матовой поверхности Фильтрашляпкой гвоздя 50 мм отмечают кружочки-метки на расстоянии 1 мм одна отдругой, располагая метки по прямой линии. В каждый,иэ них тонко оттянутойпастеровской пипеткой или пипеткой"дозатором в виде нерастекаюцейся капли вносят 1-2 мкл исследуемого материала. Номер образца записывают в рабочеи журнале в такой последовательности, как вйосят на Фильтр.На каждый фильтр наносят положи-.тельный и отрицательный контроли.Иесто нанесения определяет исследователь. В качестве контролей используютвируссодержащую культуральную жидкость, освобожденную от. клеточногодетрита центрифугированием при2000 об/мин в течение 20 мии. Заражающая доза вируса, выбор культуры клеток, состав ростовой и поддерживающейсреды, условия накопления вируса соответствуют обцепринятьв для культивируемого вируса. Для получения ротавирусного антигена (положительный контроль) ротавирусом БАинфицируютперевиваемые линии клеток почек зеленой мартышки, а для получения полиови 5 164русного антигена (отрицательный контроль) вакцигньяи штаииои вируса полиомиелита типа П 4 заражают Нер,оложительньп и отрицательньп контроли в опыт берут в двух разведенияхцельный и 1:10.Калий-калиевьп фосфатный буферньп,раствор готовят 0,15-Ц 2 И рН 7,5 с использованием 2 НОС 1 и на его основеготовят раствор с 1,5-2,07. бычьимсьвороточньг альбуминои для приготовления разведений реагентов и с0,053 твиндля промывки Фильтрапосле каждого этапа анализа.Разведения иииуной сыворотки, диагностических антител против глобухпнов кролика, антител антипероксидазы в комплексе с пероксидазой выполняют сОгласно наставлениям,Для приготовления раствора субстрата готовят 0,5 трис-НС 1 рН 7,5.Трис-НС 1 доводят до кипения, вносятсубстрат - диаминобензидин из расчета 0,4 иг/л и после охлаждения добавлявт 5 гкл/гл ЗЕ-но" перекисиводорода.Способ определения ротавирусныхантигенов осупествлянт следуюции образом.На мембранные Фильтры Ф 1 - 92с разгерогл пор 0,2-0,6 гш Деснянскогопроизводства наносят по 1-2 икл исследуегого материала и два контроля(положительный и отрицательньп). Выдерживают при когнатной температуредо высушивания и погружают в буферный раствор с 1,5-2,07. бычьего сывороточного альбумина Инкубируют при37 пС в течение 1 ч, сливают буфери заиораживают его дя повторногоиспользования,Фильтр погружают в раствор кроличьей иммуной сыворотки в отношенииротавируса ВАв рабочем разведении. Инкубируют при 37 пС в течение1 ч. Имунную сыворотку сливают и замораживают, а Фильтр трижды отмываютв буферном растворе с 0,057. твин.Затем Фильтр погружают в раствордиагностических антител против глубилинов кролика в рабочем разведении,Выдерживают при 37 ОС в течение 1 ч,сыворотку сливают и заиораживают, афильтр трижды отггвают по 4 мин в буФере с 0,057 твин,Фильтр погружаит в раствор антипероксидазных антител в комплексе спероксидазой в рабочеи разведении,5298 6Инкубируют при 37 С в течение 1 ч,сливают раствор комплекса и эамораживают Фильтр трижды отмывают в буфернгм растворе с 0,057 твини погружают в свежеприготовленгьп раствордиаиинобензидина,ерез 3-5 мин после светло-коричневого Окраиивания положительногоконтроля имиунохимическую реакцию останавливают, погружая фильтр в дистиллированную воду.Учет проводят визуально после подсушиванияна Фильтровальной бумаге.Лредлагаегьи способом обследуют164 больных острыии кишечными инфекгпяю в период спорадической заболеваемости и 66 больньх из очагов.Сравнительные данные определения20 ротавирусных антигенов в инфекционном материале от больных предлагаемыми известным способом представлены втабл, 2.Как видно из представленных данных,при исследовании инфекционного материала предлагаемым способом ротавирусьп антиген определяют в 1,5 разачаце при обследовании спорадическихбольньх и в 1,1 раза в период групповых заболеваний, сокрацая время анализа в 4,4-6 раз (разница показателейстатистически достоверна).Техника постаовки анализа позволяет повторно (до 5 раз) использовать дорогостояцие реагенты, что значительно снгоает зкономические затраты (табл. 3)40 формула изобретенияСпособ определения ротавирусныхантигенов, включаюпп взаимодействиеантител с иимобилгзовагьп на носите ле антигеном с использованием ферментной метки и буферного раствора с последувцей оценкой результатов, о т -л и ч а в ц и й с я теи, что, сцелью упроцения метода и повышениячувствительности, взаииодействиеосуцествлявт путем погружения носителя в растворы реагентов, при этом вкачестве носителя используют мембранный Фильтр, в качестве Ферментной мет ки испОльзуют антипероксидазиые антитела в комплексе с пероксидазой, в качестве буфера используют 0,15-0,2 Икалий-калиевьп Фосфатный буфер с 1,52,0 Х бычьего сывороточного альбумина.1645298 Таблица 1 Исследовано образцов серий полновнрусного антигена (отрицательньй контроль) бс,ч. бс.ч,.ч в т.ч.полозительнви в ч. зи ель ньи зул том езультаом 5 1 1 47 47 5 0 6 47 11 17 1717 10 8 .8 8 8 8 Условия проведения анализа: Сынпор 0,2 цеСБУР04/00 0,2 рФСЯ Т".РЕ0,22 И лДесняпского производства 0,2-0,6 ИвВид буферного раствораРВБ О,МрН 1,4Натрий-натриевыйфосфатный буфер0,1 И рН 7,5Трис-ИС 1 0,01 МрН 7,5Калий-калиевыйфосфатный буфер0,15 И рН 7,5Калий-калиевыйфосфатный буфер0,2 И рН 7,5Калий-калиевыйфосфатньй буферО,ЗИ рН 7,5Продолиительность инкубации с иммунной сывороткой18 ч 4 С2 ч 37 РС1,5 ч 37 С1,0 ч 37 С0,5 ч 37 фСВведение стадииинкубации с бычьимсывороточным аль- бумином13-ный бычий сывороточный альбумин1,5 Х .фекционного мариала от бальсерий ротавирусного антигена (нолоаительный контроль) половительнвв ре- зультатом1645298 Продолжение табл. 11 1 условия проведения анализа серий ротавирусного антигена (положительный контроль) инфекционного материала от больсерий полиовирусного антигена (отрицательный контроль) абс.ч. абс.ч. абс,ч. в т.ч. сполозительным в т.ч. сполоаительныю в т.ч. сполозитель" ным результатом результатом результатом 47 47 47 17 17 1 О 8 8 8 8 8 6 5 5 5 О О О О О 8 5 Таблица 2 164 . 38)4+3,8 66 55+6, Спорадические больные Больные из очагов 162 2,7,2+3,5 71 48+6Таблица 3 Расчет-обоснование зкономической эффективности предлагаемого способа определения ротавирусныхантигенов Сникенне затрат в (раз) прн использо ванин реаген- та Реагент личество реагентов бходимое для нседования 100 обцов, млОдин Многораз кратно длагее- Известжй ньа 128 5,6 28 5 1 Ьмуиная сьворотка Диагностические аи титела против глубулинов кроликаСубстрат 8 56 8 5,6 5 5 12,ОХ -"- З,ОХ -"- На вводилиТип ферментной метАнтитела диагностические против глобулинов кроликовмеченные пероксидазой 47Антитела антипероксидазные в комплексе с пероксидазой 47 Контингент обследованных Исследовано образцов Обнарукенне ротавирусных антигенов в пробах через, чт,