Штамм бактерий bacillus species 21-продуцент сайт специфической эндонуклеазы rse21 1

НИ. Е,П. (53) 1986/987.Я,Т Соы 1- Ыаагй А,3,18,Ее 11 п 1 са 1, 198 в 14511 ов врес 1 евЦИФИЧЕСКОЙ ЗН 00 М Иэобрелогическо инженерии ого штампецифиченую узнавельность ь и ма-продуце(ВКПМ В рующего с ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЭОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕН АВТОРСКОМУ СИИ(71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институ биологически активных веществ и Тих океанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения АН СС(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ Вас2 - ПРОДУЦЕНТ САЙТ-СПЕДОНУКЛЕАЗЫ Вве 21 1 ение относится к микробиопромышленности и геннойн касается получения ноа, продуцирующего сайткую эндонуклеаэу, способть и расщеплять последовануклеотидов 5 -ССТИСС,обретения - выявление штамнта Вас.11 ив врес 1 ев 2172), селективно продуцивысоким выходом сайт-спе,801518372(57) Изобретение относитя к микробиологической промышленности и генной инженерии. Цель изобретения -выявление штамма-продуцента Вас 111 цввресев ВКПМ В, селективно продуцирующего с высоким выходом сайтспецифическую эндонуклеаэу рестрикции, способную узнавать и расщеплятьпоследовательность нуклеотидов 5ССтМАСС. Штамм выделен в результате поиска штаммов-продуцентов рес 1 риктаз иэ морской воды бухты ЗолотойРог Петра Великого Японского моря.Предлагаемый штамм нетребователенк питательным средам, легко разрушается ультразвуком, обеспечивает повышенный выход целевого фермента, составляющий 30000 ед/г биомассы, ШтаммВас 11 ив врес 1 ев Впродуцируетсайт-специфическую эндонуклеазуВве 211, имеет сайт узнавания 5ССТЯАСС, идентичньй сайту узнавания рестриктазы Бац Т, и может пол ностью заменить известный во всехгенно-инженерных работах. цифическую эндонуклеаэу рестрикции,способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеодитов 5 -ССТМСС. Предлагаемый штамм выделен в результате поиска штаммов-продуцентов рестриктаз иэ морской воды бухты Зо лотой Рог залива Петра Великого Японского моря, продуцируемая им рестриктаза названа Вве 2 согласно40,0 27,0 общепринятой номенклатуре Натана иСмита.Ятамм Вас 111 цз зресдез 21 характеризуется следующими признаками.Морфологические признаки.5Клетки палочковидные, прямые, 0,61,0 и 1,5-2,5 мкм (иногда до 5 мкм),подвижные. Образуют эндоспоры овальной формы(не более одной в спорангии) 10Расположение спор преимущественноцентральное, без отчетливой раздутости спорангии. Околоспоральных телне обнаружено. Споры тврмоустойчины.Отмечается грамвариабельнссть,Культуральные признаки,Хорошо растут на обычных питательных средах (СПА, МПБ), нетребовательны к факторам роста, На агаризованныхсредах образуют круглые, плоские колонии беловатого цвета. Края ровные.При росте в ферментерах помутнениеравномерное, Оптимальная температурароста 30 ГКультуру поддерживают пересевомна агаризованных чашках Петри. Хорошохранится под вазелиновым маслом,ов растворе глицерина - при -70 Г ив лиофильно высушенном состоянии,Физиологические признаки,Хемоорганотроф. Каталазоположи"тельный, оксидазоотрицательный. утилизирует лактозу, сахарову, мальтоэу,арабинозу, глюкозу, галактозу, маннит. Не утилизирует раннозу, ксилоэу,дульцит сорбит, Реакция Фогео-Проска 35уэра отрицательная, Разжижает желати-.ну и крахмал.Для культивирования Васд 11 цзврес 1 ез 21 Вприменяют питательную среду следующего состава, г/лдистиллированной воды:ГидролизаткилькиИаС 1Вода дистиллированная ОстальноеоКультивирование проводят при 30 Ги интенсивной аэрации до достижениястационарной фазы роста.Выход биомассы: 2,0-3,0 г сыройбиомассы с 1 л питательной среды.Выход целевого фермента: 3000 ед/гбиомассы с удельной активностью20000 ед/мп,Лтамм выращивают н питательнойсреде следующего состава, г/л: гидролизат кильки 40; МаС 1 27; остальноевода. Культивирование выполняют при интенсивной аэрации (2 об,/мин), перемегинании (150 об,/мин) при 80 С до конца фазы замедления роста (5 ч). Клетки собирают центрифугированием при 1000 д и температуре 4 С. Выход биомассы составляет 2,2 г/л, Биомассу весом 2,2 г суспендируют в 20 мл 0,02 С трис-НГ 1 буфера, рН 7,5, содержащего 1 О з М меркапэтанола и 0,17. тритона Х, и разрушают на ультразвуковом диспергаторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием (120008, 30 мин) и надосадочную жидкость наносят на колонну с биогелем А 0,5 М (Во Вай) объемом 600 мл, уравновешенную 0,02 М калийфосфатным буфером, содержащим 1 ОМ меркапэтанола, 5 10 М ЭДТА 0 8 М ИаС 1 и 0 1% тритона Х(буфер А). Фермент элюируют и тем же буфером со скоростью 20 мп/ч, Фракции объемом 1 О мл собирают и анализируют на присутствие активного фермента, Фракции, содержащие максимальную рестриктазную активность, объединяют и диализуют против 2 л 0,02 М калийфосфатного буфера, рН 7,5, содержащего 10 М меркагэтанола и 5 10 М ЭДТА (буфер В), трижды меняя буфер, Диализаг наносят на колонку с ДЕАЕ-целлюлозой объемом 20 мл (ДЕЖасшап), уравновешенную буфером В. Колонку промывают буфеоом В цо исчезновения УФ-поглощающего материала в элюате, Фермент неорбируется на ДЕАЕ-целлюлозе,Раствор фермента наносят на колон" ку с фосфоцеллюлозой (Р, ЬЪасшап) объемом 5 мл, уравновешенную буфером В, и промывают колонку тем же буфером, Элюирование фермента проводят (100 мл) градиентом ИаС 1,от 00 до 1,0 М в буфере В, Объем каждой фракции 5 мч, Фракции 8-10, содержащие рестриктазу, объединяют и диализуют против буфера В, содержащего 0,1 М ИаС 1 и 50%-ный глицерин.За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщеплениямкг ДНК фага в течение 1 ч при 37 С. Ферментный препарат хранится в глицерине при - 20 С. Выход фермента 30000 ед/1 г биомассы бактерий, уд, активность 20000 ед/мл.Полученный штамм по сравнению с известным обеспечивает повышенный выход целевого фермента, составляющий 30000 ед/г биомассы (в 30 разЗаказ 6568/31 Тираж 501 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открьггиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 Производственно-иэдательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул, Гагарина, 101 5 15 больше, чем известный штамм); не требует длительного культивирования, легко разрушается ультразвуком.Поскольку рестриктаза Вде 21 имеет сайт узнавания 5 -ССТЯАСС, идентичный сайту узнавания рестриктазы,183726она может заменить известную во всехгенно-инженерных работах.Формула изобретения11 тамм бактерий Васд 11 цв вресьев 2ВК 1 И В- продуцент сайт-специфической эндонуклеазы Вве 21 1.