Способ получени -лейцин-13-мотилина

Союз Советских Социалистических Республик93659 1) Дополнительный атенту Заявлено 01, 10,76 (21) 2408600/2 3-0(23) Приоритет (31) Р 25443 (43) Опубликов Государстоенный амит Соаота Министраа ССС оо делам иаооретонийн открытий) дата опубли я 27.01.7 ваиия опи ИностранцыГерхард Вендпьбергер и Эрн (ФРГ)(72) Авторы изобретения Егер Эр Иностранная фирма лвнк-Гезельшафт цур Фердерунг дер(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ-ЛЕЙЦИН.3-ИОТИЛИН 1Изобретение относится к способу получения нового, ранее неизвестного полипептида -лейцит 13-мотилина, который может найти применение в медицине,Известен способ получения 4 -норлейцин3-мотилина 11 путем конденсации отдельных пептидных фрагментов модифицированным карбодиимидным методом 12.1 на основе дицикпогексилкарбодиимид- М-оксисукцинимида и удалением защитных групп три фторуксусной кислотой. Для синтеза Ь -норлейцин-метилина были использованы следующие защищенные фрагменты:1, Аргинил(бромгидрат) аспарагинип- )ч - -трет.-бутилоксикарбонил-лизил-глицил-гпу тамии-трет,-бутиповый эфир (аминокислоты 18-22);А( аминокислоты Пель изобр чески активны Поставпенн емым способоми повыи 9-11) Бутипн (ами т.-Бути ип-изоп 1-5) . етения ип-гпутампн трао нип кок ислотьпоксикврб трет -бутлп 6-8 ); ипе еиципипалвтп интез новых биологи роизводных мотипина твется предпа -лейцин3 цель допучени ул о 9 о -Т-бЬ-био-ьецт в о го - ОЕ. - Дг.-Ь.-ЬтоЗ 4.Н-РЬе-тсй-Рго -ЗСе-Ри я ь 4том, чтое фрагмЕэфир арЕ - Су О 0 ОФЗияи - он 1 а-пь г/ВО 08 Зи1и-. ъую бали - ОН 16-1 УФ Зи ВОС ОУВи. 1 и - : ар - Сь-оио-пь- он и-зги/ 1 и ОЮи - Ми- ОР 7 Зи ЗОФ ОЛЬг ги - ауФ - Ии- О С 1 и - ОМе И25 Раствор 80 г трет.-бутидового эфира бен- зидоксикарбонидгдицид-Ь -гдутамина в 900.мд метидового спирта по анвдогии со способом, описанным в пункте А, подвергают гидрогенодитическому деацидированию (60 г дибензодсульфимида) и переработке, Получают мвс- дообразный остаток, который кристаддизутотпри растирании с петродейным эфиром,593653гдутамид( -трет.-бутиловый эфир) - М8( 9-11); О-трет-бутидтреонид-Отрет,бутидтирозид-гдицинв (6-8) и М -трет.-бутидоксикарбонидфенидадвнид-вадид-пропил-иэодейцин-фенидаданина (1-5) с помощью ММ -дицикпогексидкарбодиимид- М -оксисукцинимида, удапяют защитные группы трифторуксусной кислотой.На фиг 1 приведена схема подучения 15фрагмента Т; на фиг. 2 - то же, фрагмен-.та Г; на фиг.:3 - то же, фрагмента 3 Д;нвфиг. 4 - схема получения фрагмента И,объединение фрагментов 1-Ш; на фиг, 5 - схе. ма получения фрагмента 1 У, объединение 20фрагментов 1 У и (Т-.И)., ЧК и У, 1-1 Ч иУ-Ч 1,На схеме и в примерах применены следующие обычные в химии пептидов сокрашения и симводы;-бутидовьм эфиром уксусной кислоты при применении серной кислоты в качестве катадизатора и йосдедующего удаления бензидоксиквр-.50.(21), в резудьтате чего подучвют эфир бен, эидоксикарбонид-дипептида( 21-2 2 в) М55-оксисукцпнимидным способом, в результа те чего образуется трет.-бутидовый эфир бен 4зилоксикарбонидтетрвпептида (19-22 а), Дипептид (19-20) получают посредством аминовцидирования Н- (чэ (ВОС)-ОН (20) с помощью Е -АЬо -ОМР(19),От соединения Х -Авп - Ьэв (ВОС)- -Мч -бЕп -01 Вн (19-22 а) бензидоксикарбонидьную защитную группу удаляли каталитическим гидрировайием, образующееся приэтом сдожноэфирное производное тетрвпеп-тида (19-22 ) конденсируют с 2- Ад(8,-Е)-Аьп - ЬЛ (ВОС)-СЬЕ -ЫЕп -01 ВоГ 18-22 а),А. Дибензодсудьфимидная соль трет,-бутилового эфира (4 .-гдутамина.103 г трет,-бутилового эфира бензидоксикарбонилгдутамина в 2 д метидового спиртаподвергают катапитическому гидрированию(пвддадиевая чернь) при прибавдении по квп-.дям 91 г дибензодсудьфимида в 500 мд метидового спирта при,рН 3,5,. Осадок отфидьтровыввют,фидьтрат упаривают в вакууме,завершвя упвривание азеотропной отгонкой с бенэодом,Раствор масдообраэного остатка в этидовом эфире уксусной кислоты смешивают с ди- .этиловым эфиром,продукт кристаллизуется,Ддя более полной очистки продукт перекристад-.дизовывают из метилов ваго спирте и диэтидового эфира, т, пд, 135-136 С,Щ =+10,78(97% от теоретически рассчитанного значения),Б. трет,-Бутиловый эфир бензидоксикарбонид-гдицид-( -гдутаминв,Суспензию 115 г дибензодсудьфимиьнойсоли трет-,бутидового эфира 4 -гдутвминав 800 мддихлорметана смешивают с 32,2 мптриэтидаминв и затем с 70,5 г бензидоксикарбонидгдицин- М-оксисукцинимидоэфира, Перемешиввние прододжвют .в течение 24 часпри комнатной температуре, затем упвривают в вакууме, масдообразный остаток раст-.воряют в этидовом эфире уксусной кислоты,раствор промывают водными растворами лимонной кислоты, бикврбонвта келия и воюй;сушат нвд сернокисдым натрием и упаривают в вакууме, Получают масдообразный про-дукт, выход 87 г (93% от теоретически рассчитанного значения).В, Дибензодсудьфимидная сопь трет,-бутидового эфира гпицип- " -гдутвмина.(4) объединяют с Н-РЪ 6-.01 Ви (5), В результате последующего каталитического гидрогенолиэа промежуточного эфира бенэилоксикарбонилдипептида (4-5 а) выделяют. Н-.ЗЬ-РЪ 6-0 Ф, Ви (4-5 с выходом вьйце90%,Одновременно фосфораэо-способом конденсируют ВОС-ЧаЕ -ОН (2 а) и Н-Рго-ОМ 44(За), в результате чего получают эфир трет, -бутилоксикарбонилдипептида ( 2-За). Последующее щелочное омыленйе сложного эфираприводит к получению с выходом более 70%ВОС-ЧсЕ.-Р 4-ОН (2-3 Ь), Волее просто ис более высоким выходом (83%) дипептид(2-3 Ъ ) получают конденсацией ВОС-Чс 43-ОВЧ (2 Ъ) с двумя эквивалентами проди"на (ЗЪ).Оба дипептидных производных объединяютс помощью карбодиимидного способа с образованием ВОС-МЕ -Р о -ЗЕВРЪаЬЭц(1-5 а) (фрагмент ЧД ).,Условия эксперимента описаны в примере 1,Выход продукта 63% по трем последнимстадйям в расчете на (4-5), т, пл, 218 С:,с(.11 - " 64,2 - 1, соответственнод2 О + о . . 2 Оо= -75,82 (с = 1 в уксусной. кислоте)Хроматографическая чистота продукта нро-верена в смеси н-бутилового спирта, ледянбй уксусной кислоты и воды, взятых в соотношении 3:1;1, и в смеси третичного амилового спирта, пиридина и воды, взятых в соотношении 35:35:ЗО.Рассчитано/найдено,%; С 64,88/64,.72;Н 7,64/7,70; М 9,70/9,61,П р "и м е р 7. Конденсация фрагментов- ЬЧ 4 (ВОС)-.ЬИ-ЕЬ 01 Би . (14-22).Соединение с фрагментом Й с помощьюукаэанного способа приводит к образованиюЕ -Ащг-(Ю -а Е 2) Мц- Мц (0 Вц )-ЮРп (ОФ, Ви )-Ьчв(ВОС)-ЬЕи (01 Вц )10и-Аг(т (НВ )-Аьп -цчь(ВОС)-И -ЬЕп0 1 В и ( 12-22 а) .Каталитическим гидрированием из ундекапептида (12-22 а) удаляют три бейзидоксикарбонильные защитные группы и в результате щейтрализации появившихся свободныхгуанидиновых функциональных групп бромистоводородной кислотой в процессе гилрирования получают Н-АфНВ )1 ео-ЬЕц (01 Во )о -бси(01 Ви )- Ьчв(ВОС)-ЬЕц(01 Ви )- -Аг(НВР )-АБП-Ье(ВОС)-ЬЬ-ЫьВО(12-22 Ъ) в форме гидробромида,Ундекапептид концентрируют с фрагментом 1 Ч (9-11) указанным дициклогексил 15 карбодиимид-В -оксибензотриазольным способом и из полученноготетрадекапептидного про- .изводного ( 9-22 с) посредством гидрогенолитического отшепления бензилоксикарбонильных защитных групп получают Н-ЬЕц -(ОЛОВО )26 -Ьеи Мо-Агу"-(НВг )-ЬецЕц (01 Ви )- 6 Еи (О Ви )-Ьв (ВОС) ЬЕи (ОС Ви )- -Агг (НВ)-Авп -Ьче (ВОС)-Из-ИиВи(9;-22 Ъ )В процессе указанной реакции объединя 25 лись фраГменты Ч (6-Яс 4) и Ч (1-5 а),последний. после переведения его в И -окси - сукцинимидный фир (1-5 Ъ). Однако чистый ВОС-РЪЕ-ЧаЕ Рго ЭВЕ РЬЕ ТМ (Ево)-Ъг ЫБи)-6 У-ОН (1-8), получить не удалось, аминокислотный анализ показал наличиепримесей в количестве примерно 10% (1-5 а) или (1-5 Ъ), Попытки разделения этойсмеси остались безуспешными.Полученный неочишенный участок ( 1-8)объединяют дициклогексилкарбодиимиц- М -(ЗОС)-Стаи -(ОМ.Ви)-АгД(НБ )-Аьн-Е,уь (ВОС)- =С, Ру -СРи - Ози -гг с 1) .После отшепления всех зашитных групп спомощью безводной трифторуксусной кислоты45 и последующей замены трифторацетатных ионов брома посредством ионообменной хроматографии на слабоосновной. ионообменной смоле фДауэкс 44" (ацетатная форма) получаютнеочищенный лейцин3-мотилин ( 1-22 й ),50который вследствие наличия неочищенногоучастка (1-8) имел ошибочную последовательность, что также подтвердилось при операции очистки,Конденсацию фрагментов проводили в сле 55дующих условияхА, Конденсация 1 со9,2 г фрагмента 1 (в соответствии спримером 1 3), 9,36 г фрагмента и (получен в соответствии с примером 2) и 1,4 млтриэтиламина в 200 мд диметилформамида1159осмешивают при 0 С с 2,3 г И -оксисукцинимида и непосредственно после этого с 3,1 г Й , М -дицикпогексипкарбодиимидаа Реакционную смесь перемешивают в течениео24 час цри 5 С и затем в течение 4 дней при комнатной температуре, после чего осадок отфипьтровывают, а Фипьтрат упариваютв вакууме. Полученный остаток несклько раэ обрабатывают водой и наконец два раза переосаждают иэ метипового и этилового"о эфира уксусной киспоты.Гопучают в Форме аморфного порошкообразного вещества трет,-бутиповый эфир бен.зипоксикарбонип- Ь. -гпутамип( -трет,-бутиповый эфир)- -гпутамип(;грет,-бутиловый эфир-Я -дерет.бутипоксикарбонил- Ьпизип- Ь -Фпутамип(-трет,-бутиповыйэфир)- Ь аргинил(гидробромид)- Ьаспарагинип- Ы. -йгрет.-бутилоксикарбонип-.Ь -лиаилглилилглугамииа,да(1 = -14,6го(а 1, а диметилфармамидериВыход 14,8 г 84%"от" теоретически расрсчитанного значения).Раствор 12,3 г полученного соединенияв 800 мп метипового спирта при поддержании постоянного эначенйя рН подвергают катапитическому гидрированию обычным образом (рН 5,5, 7 мп 1 н, бромистоводородной ЗЕкислоты), фипьтрат,упаривают в вакууме ипопученный остаток дважды переосаждаютиз этипового спирта и этипового эфира укСусной хлопотыВ реэупьтате в виде желаемого. продуктаконденсации (14-22 Ь ) попучают гидробромид, трет;,бутипового эфираЬ -гпута(ипф.-трет,-бутиповый эфир)- Ь -гпутамип(- трет,, в метиповом спирте).Выход 11,4 г (96% от теоретически рюсчитннного значения)аБ, Конденсация (1 - 5 ) с 9Раствор 1,7 г пептида (14-22 Ъ ), 1,4 г Лгр (8,ю Х ) Ьец-ОН (12-1 З), О,З г К-.оксисукцинимида и 0,14 мп триэтипамина в 100 мп диметипформамида смешивают при -10 С с 0412 г М, (и -дицикпогексипкарободиимида и реак(ионную смесь перемешивают 24 час при 4 С, затем еще 24 час при комнатной температуре. Выдепившуюся в оса док дицикпогексипмочевину отфипьтровывают, фипьтрат упаривают в вакууме ипопученный поспе упаривания остаток переосаждают из метипового спирта и этилового эфира уксус- г 912ной кислоты, Полученный продукт тщатепьнообрабатывают водой, фильтруют и сушат,В результате получают трет,-бутиповыйэфир Й , ("е , И -трис-(бензилоксикарбоА 8 щнип -аргинип-пейцип-Ь -гпутамип-(и 3-трет,бутиповый эфи)- Ь -гпутамип( г-трет-бутиповый эфир)- М -трет.бутипоксикарбонип-пиэип -гпу там ип(ф -тре т,-бу типовый эфир) -4 -аргинип(гидробромид)- 4-асЕ.парагинип-Ю -трет.-бутипоксикарбонип-,4.-пизипгпицип- )д -гпутамина (12-22 а),Выход 1,94 г (85% от теоретически рассчитанного значения).Хроматографическую чистоту продуктапроверяют путем хроматографирования в смеси н-гептана,. третичного бутипового спирта и уксусной кислоты, взятых в соотношении 3:2:1,( и в смеси н-бутипового спирта,уксусной кислоты и воды, взятых в соотношении 3:1:1.Данные аминокиспотного анапиэа:(1,8 г пептида в 500 мп метипового (-пирта подвергают деаципированию посредствомкатапитического гидрироваиия при добавпениипо каппям 15,70 мп 0,1 н. бромистоводородной кислоты, при значении рН 4,5, Катапизатор отфипьтровывают, фипьтрат упаривают в вакууме, полученный остаток переосаждают из метипового спирта и этилового эфира уксусной кислоты,-бутипоксик арбо нип-.+-пизипгпицип-;Ь -гпутамина (12-22 Ъ ),Выход 1,61 г (98% от теоретически раосчитанного значения),Рассчитано/найдено,%; С 47,12/47,20;Н 7,43/7,50; .Й 14,07/14,00В. Конденсация (1-,5-В) с Й.1,5 г пептида (12-22 1 ), и 0,87 г. пептида (9-11) в 100 мп диметипформамидаконденсируют в условиях, описанных в пункте Б способом, при добавлении 0,105 мптриэтипамина с 0,210 г Н -оксибензотриазопа и 0,320 г дицикпогексипкарбодиимидаеПопучают дигидрат трет,-бутипового эфира р 1 -бенэипокси-карбонип- Й-гпутамипф-трет.-бутиповый эФир)-. 4 -пейцип- -гпута/минип-,Ь -аргинип(гидробромид)- Ь-пейцип- Ь гпутамип(-трет.бутиповый эфир)- Й,- Ф(9-22 а),Выход 1,6 г (83% от теоретически рассчитанного значения),5Рассчитано/найдено, %: С 51,41/51,28;Н 7,57/7,55 е 8 13,63/13,57; В 1 6,22//6, 15,1,6 г пептида (9-22 а) в 600 мл метилсяваго спирта деацилируют посредством каталитического гидрирования,поддерживая посто янным значение рН,по аналогии с описаннымв пункте Б, Катализатор отфильтровывают,фильтрат упариввют в вакууме и полученныйостаток переосаждвют. из метилового спиртаи этилового эфира уксусной кислоты,Получают тетрагидрат гидробромида трет,-бутипового эфира Ь -глутамил(У 3 трет.-бутиловый эфир)-Ь -лейцил- " -гпутамитп 1 п- -аргинил(гидробромид)- 14-лейцил-" -глутвмил( -трет,-бутиловый эфи)-Ь -глутамили 36-бутиловый эфир)- Ь -аргинил(гидробромид)в .ь -аспарагинил л -трет,-бутилоксикарбоЯнил-.1 лизилглицил-.Ь -гпутаминв (9-22 Ъ ),Выход 1,5 г (96% от теоретически рас 12 о ., осчитанного. значения)ДЙ= -5,3 - 1 иЖ= -7,2 (с = 0,7, в метиповом спирте);Хромвтографическая однородность продукта показана в смеси н-бутилового спирта,уксусной кислоты и воды (3:1:1),Данные аминокислотного анализе,1 ув2,04, АЩ 2,01, АКР 0,98, Ябо 6,05,.66 м 1,10 Ь 60 2,00, 35Г, Конденсация .3 с Ч 1,2.1,6 г фрагмента б 11 и 6,9 г И -оксисукцинимида в 400 мл диметилформвмидаосмешивают при температуре -5 С с 6,3 г1 И И -дициклогексипкарбодиимида. Ревкци Ооонную смесь перемешивают 2 час при 0 Си затем в течение ночи при комнатной температуре, После фильтрования фильтрат упаривают в вакууме, Подученный маслообразный продукт кристалпнэуют иа изопропилового спирте,Получают )( -оксисукцинимидный эфиртрет;бутилоксикарбонир -фенилаланил У --валил-.Ь -пролил.-изолейцил- Ь -фенилалвнин. Выход 21,3 г (88%.от теоретическиорассчитанного значения), т, пп. 190-192 С,Ы 3 р "- + 59,28 (с -" 1,0, в диоксане).12,2 г фрагмента М и 3,8 мл триэтиламина в 400 мл диметилформамида смеши 55вают с. 148 г укаэанного выше еукцинимидного остатка, полученного из Фрагмента ЧПосле перемешивания в течение 24 чвс прикомнатной температуре реакционную смесьупариввют в вакууме и полученный мвслооб 60рваный остаток распределяют между этиловым эфиром уксусной.кислоты и раствором лимонной кислоты, Раствор продукта в этиловом эфире уксусной кислоты прочывают, сушат и упвривв 1 от в вакууме досуха, Из смеси этилового эфира уксусной кислоты ипетрогейного эфира получв 1 от в виде бесцветного кристаллического вещества трет,-бутилоксикарбонил-Ь -фенипапа 1 п 1 л- Ь -валил- Ь.Д. Конденсация (1 -Й -Й 3 - Л) с (Ч - Ч 1),1,28 г пептида (9-22 Ь)у попуче 1 ц 1 огов соответств 1 п 1 с пунктом В, 1,17 г пептидв (1-8), подученного в соответствии спунктом Г, 0,07 мт 1 триэтилвминв и 0,11.5 гЙ-оксисукцинимида (или в другом опыте0,20 г М -оксибензотриазолв) в 100 мпдиметилфосрмймида смешивают при темпервтуре -10 с 0,206 г И у И -диииклогексипкврбодиимидв. Реакционную смесь перемешиовают в течение 2 дней при О С и в течение3 дней при комнатной температуре, Полученный после удаления растворителя в вакуумеостаток тщательно обрабатывают нагретымэтиловым .эфиром уксусной кисготы, смолообразный продукт переосаждвтот из метиловогоспирта и этилового эфира уксусной кислотыи после растирания с этиловым эфиром уксусной кислоты сушат, Затем в течение 5 чвспродукт тщательно обрабатыва 1 от Водой ипереосвждвют из метилового спирта и воды.Получают гексвгидрвт трет,-бутиловогоспирта И -трет,-бутипоксикарбонил- Ь -4 енилалвнил -валил- Ь-пропил- (д -изопейцнл-фенилалвнил-О-трет,-бутил- Ь-треонил- О -(1-22 а),Выход 1,65 г (91% от теоретически рассчитанного значения),Рассчитано/найдено, %: С 54,03/54,13;Н 7, 82 /7, 80;,Й 12,6 8/12,67В г 4, 38//4,6,1 г защищенного пептида (1-22 в), полученного в соответствии с пунктом Д, смешивают с 40 мл охлажденной льдом трифторуксусной кислоты и смесь выдерживают в течение 2 час при комнатной температуре, Избыточное количество трифторуксусной кисло593659 15ты удаляют в вакууме при возможно болеенизкой температуре, попученны.й остаток растворяют в разбавленной уксусной кислоте,раствор два раза обрабатывают 4 г слабоосновного анионообменника в вцетвтной фор 5ме 1 нвпример) "Йвуэкс 44"), после чегоэлювт, полученный после проведения ионногообмена, подвергают лиофилизвции,Получают Ь -фенилвлвнип- Ь -валил-.3 --глутвмил- Ь -глу тамил- в лиэил-Ъ -глутамил- вргинил- Ь -вспарагинил-лиэилглицил- Ь-тлутамин. Выход продукта 0,74 г. )5П р и м е р 8. Получение чистого продукта и аминокислотный анализ.Очистку проводят с помощью ионообменной хроматографии при использовании сильно основной анионообменной смолы, например, находящейся в ацетатной форме и известной поц" наименованием "ОАЕ-сефадексА" смолы на.основе модифицированногодекстрана с диэтип-оксипропил)-вминоэтипьными остатками в- качестве функциональ ных групп, и затем нри применении сильно. кислой катионообменной смолы, например, находящейся в вммонийной форме и известнойпод наименованием ЗР-сефвдекс С" смолы нв основе модифицированного декстрана . 30с сульфопропильными остатками в качествефункциональных групп,Аминокислотнйй анализ проводят послекислого .гидролиза (6 н. соляная кислота)пептида) причем оказалось) что практически 35одинаковые значения достигаются при проведенйн гидропиэа в течение 20 и 72 час, Полученные результаты представлены ниже,Найдено РассчитаноЬче . 2)002 40Агд 1,93 г.Аер 1,00 10,971С) йц 6,18 6Рго О 98 45С)бч1,99 2Мс 4 О 90 1Ле 090 1 16)ео 1) 94 2 0,93 1 РЪе 1 82 2 Биологическая активность свежевысушев ного .Ь пейцин-мотилина практически равна активности;Ь -норлейцин-мотипина, таким образом, почти не отличается от активности природного мотилина, Формула изобретения Способ получения Ь -лейцин3-мотилина формулы 1 2 3 4 5 б т е 9 Н - Ие-МаВ-Рго-ЭОе-Рпе-ТЪг-Тмг-Цч)о )1 12 4 Ф 4 1 У 6 4 Т 13о т л и ч а ю щ и й с я тем, что подвергают конденсации в любой последоватепьйости защищенные фрагменты: трет.-бутиповы 9эфир аргинил(гидробромид) -аспарагинил-М - а 1 Я,-бутилтироэип-гпицина (6-8) и Й -трет;бутилоксикврбонипфенил вланил-валил-.пролил-изолейцил-фенипвланина (1-5) с помощью 9Й -дициклогексилкарбодиимид-Я-оксисукцинимида.и удалением защитных групп трифторуксусной кислотой,Источники ифиормации, принятые во внимание при экспертизе:1, Авторское свидетельство по заявкеХ) 201392)8/23-04).кл. С 07 С 103/52,1974.2. Шредер Э., Любке К. Пептиды) ч. 1Ч"Марф) 1967, с, 116.