Способ получения днк,кодирующей гормон роста лосося, способ конст-ния промежуточной рекомбинантной плазмидной днк, содержащей днк-фрагмент, кодирующий гормон роста лосося, для получения плазмид ps gh1, ps gh3,

(5115 С 12 НИЕ ИЗОБРЕТЕНИ О К ПАТЕНТ УЮЩЕЙ ГОРОБ ПОЛУЧЕ- ГОРМОНА сится к генетической получения ДНК, кодирыб, получения рекодирующих данных оба получения полоста рыб с испольэома,ения состоит в следусося( колон ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССР(71) Киова Хакко Когио Ко, ЛТД (,ЗР)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДНК, КОДИРУЮЩЕЙ ГОРМОН РОСТА ЛОСОСЯ, СПОСОБКОНСТРУИРОВАНИЯ ПРОМЕЖУТОЧНОЙРЕКОЧБИНАНТНОЙ ПЛАЗЧИДНОЙ ДНК,СОДЕРЖАЩЕЙ ДНК-ФРАГЧЕНТ, КОДИРУЮЩИЙ ГОРМОН РОСТА ЛОСОСЯ, ДЛЯПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЗЧИД РЯ ОН 1, РЯ ОН 9,РЗ ОН 10, Р 5 ОН 14 И Р 5 ОН 17, СПОСОБПОЛУЧЕНИЯ РЕКОЧБИНАНТНОЙ ПЛАЗЧИДКОЙ ДНК РЯ ОН 1 В 2, КОДИРУЩЕЙГОРМОН РОСТА ЛОСОСЯ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗЧИДИзобретение отно инженерии и касается рующей гормон роста комбинантных ДНК,гормон, а также спо ипептидного гормона ванием микроорганиз Сущность иэобрет ющем. Полную РНК получают из гипофиза логЬулсМз Ке(а) и пропускают через аполненную олиго (дТ) целлюлоНОЙ ДНК РЯ ОНПС 2, КОДИРЧОН РОСТА ЛОСОСЯ, СПОСНИЯ РЕКОЧБИНАНТНОГОРОСТА ЛОСОСЯ(57) Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения кДНК, кодирующей гормон роста рыбы. получение рекомбинантных плаэмидных ДНК, кодирующих данный гормон, в также способа получения полипептидного гормона роста рыб с использованием микроорганизма. Сущность изобретения; информационную РНК извлекают иэ гипофиэа лосося, после чего синтезируют ДНК, комплементарную иРНК (кДНК). Получают пробу ДНК, соответствующую последовательности аминокислот. Й- конца гормона роста лосося, после чего клонируют ген гормона роста лосося путем отбора кДНК, которая гибридизуется с пробой ДНК, и определяют последовательность оснований ДНК, Описана экспрессия и накопление в питательной среде гормона роста лосося в результате культивирования микроорганизма, содержащего рекомбинантную плаэмидную ДН К, в которую введена кДНК, кодирующая гормон роста лосося.4 э. и. ф-лы. зой, для выделения РНК, имеющую полиаденилировую кислоту (поли (А) РНК). Двунитевую ДНК, используя поли (А) РНК в качестве матрицы и ревертазы. Рекомбинантную ДНК синтезируют, используя 1 и Утго технологию рекомбинантной ДНК, вставляя синтезированную ДНК в векторную ДНК, трансформируют полученными ДНК штамм ЕзсЬег 1 сп)а соИ,Ниже подробно поясняется способ получения ДНК и рекомбинантной ДНК изобретения.У пойманных лососей удаляют гипофиз, который сразу же замораживают в жидком азоте, К замороженному гипофизу добавляют тиоцианат гуанидина, после чего гипофиэ размельчают и солюбилиэуют, Затем солюбилизованный гипофиз помещают в слой раствора СЯС и подвергают ультрацентрифугированию для получения в качеств осадка полной цитоплаэмической РНК, Или же к солюбилизованному материалу добавляют в месте с тиоцианатом гуанидина ОС для выделения в качестве осадка только РНК.Выделенную РНК растворяют в изотоническом растворе МаС или КО (например, 0,5 моля) и пропускают через колонку, заполненную олиго (дТ) целлюлозой, с адсорбированием в колонке иРНК, имеющей полиаденилированную кислоту (поли (А, Вымывание проводят водой или гипотоническим солевым раствором, например 10 мМ буферной смеси (трис-НС) с выделением иРНК, имеющей поли (А).Синтезируют векторную затравку, Вектор, например, рСОИ, обрабатывают Крпв соответствующем растворе, например, растворе, содержащем буфер трис-НС (например, рН 7,5, 10 мМ), МдС 2 (например, 6 мМ), МаС (например, 10 мМ). для удаления рСОИ на участке Крп, ДНК инкубируют с концевой дезоксинуклеотидилтрансфераэой при подходящей температуре (например, 37 С) в течение подходящего периода (например, 20 мин) в растворе, содержащем буфер трис-НС (например, рН 6,8, 30 мМ), кокодилат натрия(например, 140 мМ), СоС 2 (например, 1 мМ), дитиотреитол (например, 0,1 мМ), дТТФ (например, 0,25 мМ) для присоединения около 60 остатков тимидина на обоих 3-концах векторной ДНК. Затем ДНК обрабатывают в растворе, содержащем буфер трис-НС (например, рН 7,5; 10 мМ), МдС 2 (например, 6 мМ), йаС (например, 100 мМ), Раствор фракционируют с помощью низкотемпературного гелевого электрофореза на геле агарозы (в дальнейшем сокращено называемом методом НТТ) с целью выделения фрагментов ДНК примерно в 3,1 кВ. Затем ДНК растворяют в гипертоническом растворе йа С или КС (например, 0,5 М) и пропускают через колонку, заполненную поли (дА) целлюлозой с адсорбированием в колонке только молекул векторной затравки, имеющей поли (Т), Вымывание проводят водой или гипотоническим солевым раствором, например буфером трис-НС, для выделения молекул только векторной затравки с поли (Т).Затем синтезируют связующую ДНК. Например, рДНК обрабатывают Рвт в подходящем растворе, например, растворе,содержащем буфер трис-НС (например, рН7,5; 10 мМ), МдС 2 (например, 6 мМ), йаС(например, 50 мМ) для удаления р 1 на участке рз 1, Затем ДНК обрабатывают так же,как при синтезе векторной затравки, эа темисключением. что вместо дТТФ добавляютдСТФ и вводят примерно 15 цепей олиго(например. 60 мМ). Фрагмент ДНК примерно в 0,5 кВ фракционируют электрофорезомна геле агароэы и выделяют на ЕАЕ-бумаге.Тем самым получают связующую ДНК.Полученные поли (А) РНК, векторную затравку и связующую ДНК используют длясинтеза кДНК, который заключается в сле 20 дующем, Поли (А) РНК и векторную затравочную ДНК вводят в реакцию с ревертазойи ри подходя щей температуре (например,37 С) и в течение подходящего периода времени (например, 40 мин) в растворе, содер.жащем буфер трис-НС (например, рН 8,3;50 мМ), МдС 2 (например, 8 мМ), КС (например, 30 мМ) дитиотреитол (например,0,3 мМ), дАТФ, дТТФ, дЦТФ и дГТФ (например, каждого по 2 мМ). Примерно 15 олиго 30 (дЦ)-цепей присоединяют к 3-концамполученной РН К-ДН К двойной нити в тех жеусловиях, что и в случае присоединения (дТ)- цепей к векторной затравке. за исключением того, что вместо дТТФ применяют дЦТФ.35 В подходящем растворе, содержащем буфер трис-НО (например, рН 7,5; 10 мМ),МдС 2 (например, 6 мМ), йаС (например, 60мМ), ДНК обрабатывают Нпб . Ранее полученную связующую ДНК смешивают с ДНК40 и приготовленную смесь инкубируют ДНКлигазой Е.соИ при подходящей температуре(например, 12 С) в течение подходящего периода времени (например, 16 ч) в растворе,содержащем буфер трис-НО(например, рН45 7,5; 20 мМ), МдС 2 (например 4 мМ),(ЙН)250 (например, 10 мМ), КС (например, 0,1 мМ) и Р-никотинамидадениндинуклеозид ф-НАД) (например, 0,1 мМ) дляприготовления кольца кДНК и связующей50 ДНК. К реакционному раствору добавляют40 мкМ (конечная концентрация) каждого:дАТФ, дТТФ, дГТФ м дЦТФ, Для замещения РНК-части ДНК и получения рекомбинант ной плазмиды, содержащей55 двунитевую кДНК, добавляют ДК-лигаэу,ДНК-полимеразу 1 и рибонуклеазу Н.ЕзсЬегсЫа соИ,Штамм ЕзсйегсЫа со, например,Езс 1 егсЬа соИ с 600 ЯЕ 8, трансформируютс помощью полученной рекомбинантной плаэмиды. Поскольку в укаэанной плаэмиде имеется ген устойчивости к ампициллину, трансформант ЕэсЬег 1 сЬа со 1 также устойчив к амплициллину,Отбор штамма микроорганизма, несущего новую рекомбинантную плазмидную ДНК с геном, комплементарным иРНК гормона роста рыб, из устойчивых к ампициллину (Ап) проводят следующим образом. Полученный трансформант фиксируют на фильтре иэ нитроцеллюлоэы и с ним гибридизируют искусственную пробу, имеющую ДНК-последовательность, которая была задана последовательностью аминокислот известного полипептидного роста лосося, с целью отбора трансформанта, проявляющего повышенную гибридизацию. Пробу ДНК синтезируют обычным триэфирным методом. Рекомбинантную плазмиду, комплементарную иРНК гормона роста лосося, идентифицируют вышеуказанным методом.Полученными таким способом рекомбинантными плазмидами являются рЯ ОН 1 и рБОН 14, Плаэмиды используют в качестве источника ДНК, кодирующей гормон роста лосося.Способ получения полипептидного гормона роста лосося экспрессией ДНК, кодирующей гормон лосося, в микроорганизме состоит в следующем;ДНК, кодирующую гормон роста лосося, отсекают от плаэмиды, несущей ДНК, и вставляют в векторную ДНК. Полученной рекомбинантной ДНК трансформируют микроорганизм и трансформант культивируют с целью накопления в питательной среде полипептидного гормона роста лосося, Затем из культуры выделяют гормон роста лосося,Примерами плазмид, содержащих ДНК, кодирующую гормон роста лосося, являются плазмиды рЯОНС 1 и рЗОН 14,Применяют векторные ДНК, в которые встраивают чужеродную ДНК в рамке считывания от подходящего промотора, например, тгр-промотора, вас-промотора или Р 2-промотора, и длину между последовательностью Шайн-Дальгарно(далее обозначается как последовательность ЩД) и инициирующим кодоном (АТГ) устанавливают, например, в 6-18 основных пар, Предпочтительно использование векторной ДНК - рОЕ 1.1.Рекомбинацию ДНК, кодирующей полипептид, и векторной ДНК осуществляют общеизвестными пр демами.Получают МЬо 1-Яа фрагмент, кодирующий гормон роста лосося, ЯаИ-ВавН фрагмент, а также НиМВатН фрагмент45 50 ся в результате гидролиэа рестриктазами, проводят методом НТГ или электрофорезом на полиакриламидном геле,Связывание фрагментов ДНК проводят с помощью Т 4-ДН-лигазы (0,3-10 единиц) в смеси 2-200 мМ, предпочтительнее 10-40 мМ, трис-НО (рН 6,1 - 9,5, предпочтительнее 7-8), 2-20, предпочтительнее 5-10 мМ М 9 С 12, 0,1-10 мМ, предпочтительнее 0,5-2 мМ, АТФ и 1-50 мМ, предпечтитель 10 15 20 25 30 35 40 плаэмиды рОЕ.1, содержащий триптофвновый промотор. Искусственную линкерную ДНК получают по приведенной схемеНид 1 П М 60 п 5 АССТТАТСАТАСАААААС ГЗ Эф АТАСТАТСТТТТТ 5 ф Ме 1 11 еОРа А ЯлрФрагменты ДНК и линкерную ДНК сшивают с помощью Т 4-ДНК-лигаэы получают рекомбинантную плазмиду рЯОН 1 В 2, которая кодирует зрелый гормон роста лосося.Из рЯОН 1 отдельно получают МЬо ИРЧО И фрагмент, кодирудющий область вблизи М-конца зрелого пептида гормона роста лосося, и РЧО И-Н 1 пЬ И фрагмент, содержащий оставшуюся кДНК и векторную часть. С другой стороны линкерную ДНК получают по приведенной схеме.Ниб П М%П 5 ф АССТТАТССААААС Зф Зф АТАСС-ТТТТ5 фМеГ ОМ А 5 йФрагменты ДНК и линкерную ДНК связывают с помощью Т 4-ДН К-лигаэы и получают рекомбинантную плаэмиду рЯОН 11 В 9. Затем иэ плазмиды рЯОН 11 В 9 получают НпЬ И 1-Ваа Н 1 фрагмент, содержащий зрелый пептид гормона роста лосося, а из рСЕ 11 получают НпЬ И 1-Вагп Н фрагмент, содержащий триптофановый промотор. Оба фрагмента связывают с помощью Т 4-ДНК- лигазы для получения плазмиды рЯОН 11 С 2.Обработку ДНК ресктриктазами прово; дят следующим образом: 0,1-2 мг ДНК с О, 1-100 единицами, предпочтительно с 1-3 единицами рестриктазы на 1 мг ДНК в смеси 2 - 200 мМ; предпочтительно 10 - 40 мМ, трисНС 1 (рН 6-99,5, предпочтительно рН 7 - 8), 0-00 мМ чаС 1 и 2-30 мМ, предпочтительнее 5-10 мМ, М 9 С 12 при 20-70 С (оптимальная температура зависит от применяемого ограничивающего фермента) от 15 мин до 24 ч. Прекращают реакцию обычно нагреванием до 55-75 С в течение 5 - 30 мин или же инактивацией фермента с помощью такого реагента, как фенол или диэтилпирокарбонат.Очистку фрагментов ДНК, образующих 182537655 нее 5-10 мМ, дитиотреитола при 1-37 С, предпочтительнее при 3 - 20 С, от 15 мин до 72 ч, предпочтительнее в течение 2 - 20 ч.Полученную рекомбинантную плазмиду ДНК вводят вб Езс 1 егсЫа со.Выделение рекомбинантной плазмидной ДНК ЕвсегсЫа со осуществляют мето,дом, описанным в примере 1,Плазмиду ДНК гидролизуют 1 - 10 видами эндонуклеаз, места расщепления изучают с помощью электрофореза на геле агарозы или на полиакрилоамидном геле. В случае необходимости, последовательность оснований ДНК определяют методом Мадхав-ОЬеп или методом Яапяег,Штамм Езсегсна со КНВ 101 трансформируют с помощью плазмид рЯОН 11 С 2 и рЯОН 1 В 2, после чего штамм ЕзсЬегсЫа соИ, несущий рЗОН 11 С 2 или рЯОН 1 В 2, отбирают из устойчивых к ампициллину колоний. Штамм ЕзсЬегсЬа со, несущий рЯОН 1 В 2 или рЯОН 11 С 2, культивируют в питательной среде с получением в клетках культуры полипептидного гормона роста рыб.В качестве питательной среды используют искусственную или естественную среду, если только она подходит для выращивания ЕзсЬегсЫа со или для производства полипептидного гормона роста , рыб.В качестве игточника углерода используют глуюкозу, фруктозу, глицерин, маннит, сорбит и т. д,В качестве источника азота используют МН 4 С, (МН 4)2304, казаминокислоты, дрожжевой экстракт, полипептон, мясной экстракт, бактотриптон, зерновой экстракт и т. д Кроме того, используют питательные вещества как К 2 НР 04, КН 2 РО, МаС, МЧЯОа витамин В 1 и МяС 2,Культивирование проводят при рН 5,5- 8,5 и 18 - 40 С при аэрации и перемешивании.В результате культивирования в течение 5 - 90 ч в культуральных клетках накапливается полипептидный гормон роста лосося. Собранные клетки обрабатьвают лизозимом, разрушают неоднократным замораживанием и оттаиванием и подвергают центрифугированию. Полученную таким образом надосадочную жидкость подвергают экстрагированию обычным методом экстракции полипептидов с целью их выделения,Детектирование полипептида проводят растворением при нагревании в буфере Яаевв и действием НДС на полиакриламидном геле и окрашиванием реактивов Соотаззе Вгап 1 голубым. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Изобретение иллюстрируется следующими примерами.П р и м е р 1. 2 г замороженного гипофиза лосося (от 30 особей) разрушают и гомогенизируют в 10 мл раствора, содержащего 4 М тиоцианатагуанидина, 0,5саркозила, 5 мМ цитрита натрия (рН 7) и 0,1 М В-меркаптоэтанола. Гомогенат пропускают через инжектор на 18 О и помещают в слой 5,7 М СЗС и 0,6 М ЭДТА (рН 8) по 1,2 мл каждого раствора в ультрацентрифужных пробирках. РНК осаждают центрифугированием при 35000 об/мин в течение 15 ч, Осадок РНК растворяют в растворе трис-НС (10 мл, рН 8), содержащем 1 мМ ЭДТА, экстрагируют смесью фенол: хлороформ и осаждают этанолом, 1 мг полученной РНК растворяют в 1 мл 10 мМ трис-НС (рН 8) и 1 мМ ЭДТА, инкубируют при 65 С в течение 5 мин, добавляют 1 мл 5 М чаС. Смесь хроматографируют на олиго-дТ целлюлозе (производство Р- Восбексаз обаем колонки 0,5 мл), Абсорбированную на колонке РНК, содержащую поли (А), вымывают раствором 10 мМ трис-НС (рН 7,5) и 1 мМ ЭДТА, порциями по 0,2 мл с получением примерно 10 мг иРНК (3 - 5 фракции).Пример 2,Синтез кДНК и конструирование рекомбинантной плазмиды.400 мкг ДНК плазмиды рСОЧ добавля.-, ют к 300 мл раствора, содержащего 10 мМ трис-НС (рН 7,5), 6 мМ МдС 2 и 10 мМ йаС, и затем 500 единиц Крп (производство ТаМача зйцло Со, все использованные ферменты являются продуктом Та:ача зЬыо Со, если нет особых указаний добавляют, Реакцию проводят при 37 С 6 ч. После эктрагирования смесью фенол; хлороформ ДНК осаждают этанолом.200 мг ДНК, гидролизованной рестриктазой Крп 1; добавляют к 200 мл раствора, приготовленного добавлением 0,25 мМ дТТР к буферу (далее упоминаемого просто как буфер) содержащему 40 мМ какодилата натрия,30 мМ трис-НС 1(рН 6,80), 1 мМ СаС 2 и 0,1 мМ дитиотреитола (далее обозначаемого как ДТТ), Затем добавляют 81 единицу концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы (далее обозначаемой как КдТ) и реакцию ведут 11 мин при 37 С, Таким образом, к 3 концам рСОч, расщепленной с помощью Крп, присоединяют около 67 поли (дТ) цепей. Экстрагируют смесью фенола с хлороформам, из раствора выделяют в результате осаждения этанолом примерно 100 мкг рСОч ДНК, связанной с поли (дТ) цепями. Полученную ДНК добавляют к 150 мл буфера, содержащего 10 мМ трис-НС (рН 7,5), 6 мМ МцС 2 и 100 мМ МаС. Затем добавляют10 15 100 единиц ЕСОВ и в течение 2 ч при 37 С проводят реакцию, Продукт реакции подвергают НТГ для получения фрагмента ДНК примерно в 3,1 кВ, который представляет собой примерно 60 мкг рСОИ с поли (дТ) цепями. Полученную ДНК растворяют в 500 мл раствора, содержащего 10 мМ трис-НС (рН 8) и 1 мМ ЭДТА. Приготовленный раствор инкубируют 5 мин при 65 С, после чего при охлаждении льдом добавляют 50 мл 5 М раствора йаС 1. Полученную смесь подвергают колоночной хроматографии на олиго (дА) целлюлозе с адсорбированием на колонке ДНК, имеющей достаточное количество поли (дТ)-цепей, Вымывание проводят раствором,содержащим 10 мМ трис-НС(рН 8) и 1 фМ ЭДТА, с получением 27 мкг рСОИ с поли (дТ) цепями (далее называемый векторной заправкой).Затем описанным способом получают линкерную ДН К.Примерно 14 мкг р 1 добавляют к 200 мл буфера, содержащего мМ трис-НС (рН 7,7), 6 мМ МцС 12 и 50 мМ йаС 1. Затем добавляют 50 единиц Рзб и для отсечения р 11 ДНК в области Рзб 4 ч при 37 С ведут реакцию. Продукт реакции подвергают экстрагированию смесью фенола с хлороформом и осаждению этанолом с получением 13 мкг р 11 ДНК, усеченной в Рз 11-области. Примерно 13 мкг полученной ДНК добавляют к 50 мл КдТ буферу, содержащему 0,25 мМ (конечная концентрация) дГТФ. Затем добавляют 54 единицы КдТ и инкубируют 13 мин при 37 С с присоединением примерно 14 (дГ) цепей у С-концах р 11, усеченной с помощью Рзт 1. Выделяют ДНК экстрагированием смесью фенола с хлороформом и осаждением этанолом. Полученную ДНК добавляют к 100 мл буфера, содержащего 10 мМ трисНС 1(рН 7,5), бмМ МцС 12 и 60 мМ йаС. Затем добавляют 80 единиц Н 1 пб 111 и инкубируют 3 ч при 37 С с целью удаления р 11 ДНК в Н 1 пс 11-области, Продукт реакции фракционируют электрофорезом на геле агарозы, после чего выделяют фрагмент ДНК примерно в 0,5 кВ, используя метод с ЕАЕ-бумагой, Полученная ДНК является связующей ДНК с олиго (дГ) цепями (далее называемая связывающей ДН К).Примерно 2 мкг поли (А) РНК и примерно 1,4 мкг векторной затравки, полученной указанным способом, растворяют в 22,3 мл раствора, содержащего 50 мМ трис-НС 1 (рН 8,3), 8 мМ МцС 12, 30 мМ КС 1, 0,3 мМ ДТТ, 2 мМ дНТФ (дАТФ, ДТТФ, дГТФ и дЦТФ) и 10 единиц рибонуклеазного ингибитора. Затем добавляют 10 единиц релертазы и инкубируют 40 мин при 37 С с целью получения ДНК, комплементлрной РНК Продукт реак 20 25 30 35 40 45 50 55 ции экстрагируют смесью фенола с хлороформом и осаждают этанолом с выделением вектора-затравки ДНК, связанной с двойной нитью РНК-ДНК. ДНК растворяют в 20 мл КдТ-буфера, содержащего 66 мкМ дЦТФ и 0,2 мкг поли (А). Затем добавляют четырнадцать единиц КдТ и в течение 8 мин при 37 С проводят инкубирование с присоединением к 3-кольцам кДНК 12 (дЦ)-цепей. Продукт реакции подвергают экстракции смесью фенола с хлороформом и осаждению этанолом с выделением кДНК-вектора- затравки ДНК. связанной с (дЦ) цепями, Полученную ДНК растворяют в 400 мл раствора, содержащего 10 мМ трис-НО (рН 7,5) 6 мМ МцС 12 и 60 мМ МаС 1. Добавляют 20 единиц Н пб 111 и инкубируют 2 ч при 37 С с отсечением ДНК в Нпс 1-И 1-области. Продукт реакции экстрагируют смесью фенола с хлороформом и осаждают этанолом с получением 0,5 пмоля кДНК-вектора-затравки ДНК, связанной с (дЦ) цепями. Затем 0,08 пмоля ДНК и 0,16 пмоля упомянутой связующей ДНК добавляют к 40 мл раствора, содержащего 10 мМ трис-НС (рН 7,5), 0,1 М йаС и 1 мМ ЭДТА, и инкубируют при 65 С, 42 С и 0 С в течение соответственно 10, 25 и 30 мин. Реакционный раствор доводят до 400 мл (полный объем) раствора. содержащего 20 мМ трис-НС 1 (рН 7,5) 4 мМ МцС 12, 10 мМ (НН 4)2504, 0,1 М КС 1 и 0,1 мМ Р.НАД, К реакционному раствору добавляют 10 единиц ДНК-лигазы Езсег 1 сЬ 1 а со 11 и инкубируют в течение 1 сут при 11 С. Реакционный раствор доводят до раствора, содержащего 40 мкМ дНТФ и 0,15 мкМ /3-НАД. Затем добавляют пять единиц ДНК-лигазы ЕзЬегсп 1 а со 1, 2 единицы рибонуклеазы Н ЕзсЬег 1 сЬа сои 7 единиц ДН К-полимеразы 1 ЕзсЬгс 1 а со 1 и инкубируют сначала 1 ч при 12 С и затем еще 1 ч при 25 С. Приведенной реакцией осуществляют циклиэацию рекомбинантной ДНК, содержащей кДН К, и ричем часть двуните вой Р Н К-ДН К замещается ДНК, в результате чего образуется рекомбинантная плазмида, содержащая полную двунитевую ДНК,П р и м е р 3. Езспег 1 сЬа со 1 600.Г 8 трансформируют, используя рекомбинантную плазмиду, полученную в примере 2. Среди примерно 10000 колоний, полученных по этой методике, 4800 колоний закрепилисв на нитроцеллюлозе. Отбирают восемь штаммов, накрепко гибридизирующихся при 40 С с пробой, причем Д 11 К соответствует последовательности аминокислот от 23-ей и до 28-ой, начиная от М-конца гормона роста лосося, а именно1234567891011121314151617(3-е основание является А или С, 9-е - Т или С, 12-е - С или Т, 15-е - С или Т, и комбинацией укаэанных оснований получают 16 видов искусственных ДНК) помечаютР, Методом Яоо 1 пегп подтверждают, что 8 штаммов гибридизуются с упомянутой пробой, и искусственная ДНК-проба соответствует последовательности аминокислот вокруг С-конца:1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 САСАЯАОТАОАОАС(3-е основание является С или Т, 6-е - А или С, 9-е - А, Т, С или С, 12-е - С или А и комбинация оснований дает 32 года искусственных ДНК). Плазмиды, названные соответственно рЯОН 1, 3, 6, 8, 9, 10, 14 и 17 имеют ДН К-последовательность, заданную последовательностью аминокислот в известном гармоне роста лосося и, как полагают, содержат кДНК гормона роста,П р и м е р 4. 8 плазмид, полученных указанным способом, гидролизуют различными эндонуклеазами, после чего определяют карты расщепления частей кДНК. Плазмиды разбивают на три группы, а именно группу рЗО Н 1, 6, 9, 10 и 17, группу рЗОНЗ и группу рЯОН 8 и 14 исходя из положения участков ограничивающей эндонуклеаэы,Полную последовательность нуклеотидов трансляционной области плазмид, которые хорошо гибридизуются с пробой искусственной ДНК (см, пример 3) и которые, как полагают, содержат почти полную кДНК, в особенности рЯОН 1, определяют по методу Яапцег с использованием М 13- фага, Основания под номерами 1-66 кодируют сигнальный пептид, а 67 - 630 кодируют зрелый полипептид гормона роста лосося,Плаэмиды рБОН 8 и рЯОН 14 отличаются друг от друга следующим образом, рЯОН 14 содержит более длинную кДНК почти полной длины. Последовательность основания в рЯОН 14 определяют по методу Яапцег, используя М 13-фаг.Основания 1 - 66 кодируют сигнальный пептид, а под номерами 67-630 кодируют зрелый полипептид гормона роста лосося.Полипептид, закодированный кДНК, полностью совпадает с полипептидом, закодированным с помощью рЗОН 1 в 22 аминокислотах сигнального пептида, но различается 12 аминокислотами зрелого пептида иэ 188 аминокислот. Далее, еслиречь идет о последовательности 1 Ч-концевых 40 аминокислот, определенной в пол. ипептидном гормоне роста лосося, то 5 аминокислот в ней явно отличны, Таким образом, считают, что кДНК, содержащаяся е рЗОН 14, кодирует гормон роста рыб, отличныи от рЗОН 1.П р и м е р 5. 5 мкг плазмиды рЯОН 1, кодирующей полипептидный гормон роста лосося, растворяют в 40 мл раствора, содержащего 20 мМ трис-НС 1 (рН 7,5), 10 мМ М 92 С 2 и 10 мМ йаС (далее называемый буферным раствором У), Затем добавляют 10 единиц рестриктаэы МЬо 11 и в течение 3 ч при 37 С проводят реакцию гидролиза. Затем концентрацию йаС в растворе доводят до 175 мМ, после чего добавляют 10 5 10 15 единиц Яа 1 т. Снова проводят реакцию гидНо о 11 нпа а а А Т С А Т А С А А А А С, -Эф 17 РегТ А С Т А Т С Т Т Т Т-512 .лт. Но 1 1 е 1 Яп-Асстт 5 ф 55 Две единичные нити ДНК в 17-аег и 12-пег синтезируют обычным триэфирным методом, Затем 17-п 1 ег и 12-п 1 ег ДНК по 12 пмолей каждой растворяют в 20 мл раствора, содержащего 50 м М трис Н О (р Н 7 5)- 10 ролиза в течение 3 ч при 37 С, Методом НТГ 20 получают примерно 0,2 мкг фрагмента ДНКв 163 Ьр, соответствующего М-концевой области.Затем 5 мкг рЯОН 1 растворяют в 40 млраствора, содержащего 20 мМ трис-НС (рН 25 7,5) 10 мМ М 9 С 12 и 100 мМ йаС 1(далее называемом буферным раствором У). Добавляют десять единиц Ват Н 1, после чего е течение 3 ч при 37 С проводят реакцию гидролиза. Затем концентрацию йаС 1 в ре акционном растворе доводят до 175 мМ идобавляют 10 единиц ЯаИ. Снова проводят в течение 3 ч при 37 С реакцию гидролиза;методом НТГ иэ реакционного раствора выделяют примерно 0,5 мкг фрагмента ДНК 35 900 Ьр, содержащего С-концевую область и3-нетрансляционную область.Отдельно растворяют в 40 мл буферногораствора У5 мкг рСЬ и добавляют Вагп Н 1 и Н 1 пб 11 по 10 единицкаждого, При 30 С 40 в течение 3 ч проводят реакцию гидролиза,,после чего из реакционного раствора выделяют примерно 1 мкг фрагмента ДНК в 2,7 кВ, содержащего триптофановый и ромотор.С целью присоединения трансляцион ного инициирующего кодона АТГ, необходимого для экспрессии ДНК, кодирующей полипептидный зрелый гормон роста лосося, и для связывания векторной ДНК и вышеупомянутой ДН К, синтезируют липидную 50 ДНК по приведенной схеме.50 55 мМ МцС 12, 10 мМ дитиотреитола и 1 мМ АТФ. Добавляют шесть единиц Т 4-полинуклеотидкиназы и при 37 С в течение 60 мин проводят реакцию фосфорилирования,Затем 0,1 пмоля МЬо И-Яа 1-фрагмента (163 ор) рЫН 1, 0,06 пмоля Ба 1 1-Ваа Н 1- фрагмента (примерно 900 ор) рЯОН 1 и 0,02 пмоля Нп 6 И - Ваа Н 1-фрагмента(примерно 2,7 Кв) рОЕ 1, полученных вышеуказанными способами, растворяют в 30 мл раствора, содержащего 50 мМ трис-НС (рН 7,5), 10 мМ МцС 12, 10 мМ дитиотреитола и 1 мМ АТФ, Затем добавляют 5 мл раствора для осуществления реакции фосфорилирования искусственной ДНК, полученного вышеприведенным способом, К полученной смеси добавляют шесть единиц Т 4-ДНК-лигаэы и при 4 С в течение 18 часов проводят реакцию связывания,Для получения Апг-колонии трансформируют Е.со 11 НВ 101. Из колонии выделяют плазмиду ДНК рЯОН 1 В 2 с помощью полиакриламидного геля и использованием ДЕАЕ-бумаги. Выделяют примерно 0.05 мкг фрагмента ДН К размером 108 ьр, соответствующего й-концевой области.Затем 5 мкг рЗСН 14 растворяют в 40 мл раствора, содержащего 20 мМ трис-НС (рН 7,5), 10 мМ МцС 12 и 50 мМ йаС 1 (далее называемом буферным раствором У). Затем добавляют РЧО И и Нп 6 И 1 по 10 единиц каждого и в течение 3 ч при 37 С проводят реакцию гидролиэа. Методом НТГ иэ реакционного раствора выделяют примерно 0,5 мкг фрагмента ДНК размером 3,3 кВ, содержащего С-концевой участок и 3- нетрансляционный участок гормона роста, образованного из рЯОН 14 и части вектора.Для присоединения трансляционного инициирующего кодона АТГ, необходимого для экспрессии ДНК, кодирующей полипептидный зрелый гормон роста лосося и для связывания векторной ДНК и упомянутой ДНК, синтезируют по приведенной схеме связующую ДН К.нла ш кЬеп5 ЛССТТ 1 ТС СЛ АА ЛС -3 14 тр 3 -Л Т А С С Т Т Т Т 51 9 ткгие 1 Ио А 5 А Две единичные нити 14-гпег и 9-щегсинтезируют обычным триэфирным способом, Затем 14-п 1 ег и 9-п 1 ег ДНК по 39 пмолей каждой растворяют в 20 мл раствора, содержащего 50 мМ трис-НС 1, 10 мМ МцС 2, 10 мМ дитиотреитола и 1 мМ АТФ, Добавляют шесть Т 4-полинуклеотидкинаэы и в течение 60 мин при 37 С ведут реакцию фосфорилирования, Строение рЯОН 182 исследуют расщеплением с помощью ЕСоЮ, Н 1 п 6 И 1,5 15 20 25 30 35 40 45 С 1 а 1, Вце, За 1, и Вагп Н 1 и электрофореэом на геле агарозы. Последовательность ДНК, кодирующую Й-конечную область попипептидного гормона роста лосося в рЯОН 1 В 2, устанавливают методом Яапцег используя Ч 13-фаг.Неб В абоп А АССТТ ЛТТС АТАСААААС )САА Т ТССАА ТАСС ТАТСТТТБ СТТМеф Я Р йи /5 а йЬУВ результате подтверждают, что рЯОН 1 В 2 содержит ДНК, кодирующую зрелый полипептидный гормон роста лосося.П .р и м е р 6. 1) Конструирование иэ рЯОН 14 рекомбинантной плазмиды рЯОН 1189, кодирующей зрелый гормон роста лосося: 5 мкг плазмиды рЯОН 14, кодируюцей гормон роста лосося, растворяют в 100 млраствора, содержащего 20 мМ трис-НС (рН 7,5), 10 мМ МцС 12 и 10 мМ йаС 1. Затеи добавляют 10 единиц рестриктаэы МЬо И и при 37 С в течение 3 ч проводят реакцию гидролиза. Концентрацию йаО в растворе доводят до 50 мМ, после чего добавляют 10 единиц РЧ 01. Снова проводят в течение 3 ч при 37 С реакцию гидролиза, Из реакционного раствора электрофорезом на полиакриламидном геле выделяют плаэммдную ДНК,Затем 0,08 пмоля МЬо 1-РЧО И-фрагмент (108 Ьр) рЗОН 14 и 0,02 пмоля РУ. 1-Нп 6 1-фрагмент (примерно 3,7 кв) рЯОН 14, растворяют в 30 мл растворе, содержащего 50 мМ трис-НС (рН 7,5), 10 мМ МцС 12, 10 мМ дитиотреитопа и 1 мМ ДТФ. Затем добавляют фосфорилированную синтетическую ДНК в количестве 5 мл, К полученной смеси дббавляют шесть единиц 14-ДНК-лигазы и при 4 С в течение 18 ч ведут реакцию связывания.Используя полученный реакционный раствор, трансформируют ЕвсЬег 1 сйа со 1: Н 8101, получают Агпг-копонию, из котордй выделяют плазмиду ДН К рБОН 1189. Строение рЯОН 1189 устанавливают расщеплением с помощью Н 1 п 6 И, ХЬ 1, ВоИ и Ваа Н и злектрофорезом на агароэном геле,2) На этой стадии 5 мкг рЯОН 11 В 9 рас- . творяют в 40 мл буферного раствора У, после чего добавляют Вагп Н и Н 1 п 6 1 И по 10 единиц каждого. Затем проводят в течение 3 ч при 37 С реакцию гидролизаМетодом Н ГТ из реакционного раствора выделяют примерно 0,1 мкг фрагмента ДНК примерно в 1200 вр, кодирующий полный полипептидный гормон роста взрослого лосося,Отдельно растворяют 5 мкг рСЕ. в 40 мл буферного раствора У,после чего добавляют Ваа Н 1 и Нп 6по 10 единиц каждого. После про1825376 15 16 Формула изобретения 1. Способ получения ДНК, кодирующей гормон роста лосося, заключающийся в том, что экстрагируют мРНК из гипофиза рыбы путем пропускания через колонку с олиго- (аТ)-целлюлозой, синтезируют кДНК со следующей нуклеотидной последовательностью: 1 О 20 за аа 50 60 10 га эо 40 50 60 дтакдсддататттстктсдтассдатсттдстаатсааттатттссадатсддааа лтссслсллстстттстсстслтссглстсттлстсстслсттстттсстслстсллссо 33 еса 1 у 63 пцаРьеьецьецс 3 егРгоча 1 ьец 3.ецйа 3 5 гсуеРьеьецзега поу,иегс 136 юяа 1 рьеьеиьеинегрсоиеьецьецча 15 гсуврьеьсцвесс 1 пс 1 у 70 во 90 100 110 120 сссссслтссллллссллсссстсттсмслтсстсстсмссссстссмслсстссдс А 1 А 1 а 31561 цлепс 1 плсвЬецРЬелэп 11 ецараэлвплгвра 1 С 1 пввЬце в ТО ва 90 ОО 33 о го осдасодтдаддддссддсаастсттсддсдтсасаатсдатсааа 1 асдасдтстсслс Аад 1 а 161 цдэп 61 пдгрЬчРЬЛап 1 Ааиа 15 егагрра 63 пНе 3 ецНээзо эао 15 о 160 эта ВО стдтткстсдаддддтаттсадтадстттадсаатдссстаттассталталдсасдад Ьец.цлва 1 пЬузгсегРЬдзпдзоРЬдзоауТЬгЬцЬецРгодзоацдгрдгр 130 140 150 160 170 160 стлттссстслсллмтсттсллсслстттсмссслссстсттстстслтсллссосл ЬецЬецл 1 аа 1 пЬувнеГРЬлапдзррпеаэо 613 ГТЬсЬцЬеовесдврс 1 цдсрдср 190 200 210 220 2 ЭО 240 190 гоо 2 о гго гэо 140 сассталдслдадтдгтсстастаадсттстатддстстадстссдтсатассссдатс слсбтсмсллслтлттсстсстсслсттстстмстстслстсслтсстслссссслтс 61 п.ецдап 3 уэ 1 РьЬч 3 цдерРЬСуздзп 5 гАэо 5 г 1 и 15 гРгоиа С 1 пЬецлвпЬув 11 РЬЬецЬецдврРЬеаувдапяеглврвег 11 еиа 16 есрсо 15 25 о гбо гто гва гро зао 250 260 270 160 190 300 адсддатдсададстсдадаадаттсдстсстсддастктстдсдтттстттссатсто слсмсслсслслстслсллслсттслстсстсмсстсстсслтлтстстттссссстс АерЬуетуг 61 цт 1 ъгапЬувеегзегиаЬчЬуэЬцЬчтрг 13вегрьедгрф ец ЛврЬувС 1 пС 1 цть 61 пгувеегвегцаЬеоЬувьеиЬеояа 11 ееесРЬелсрЬец э 10 э 20 ээа эаа э 50 эба 310 320 ЗЗО 340 350 360 дттаддтсстакдатдссстдассдадссстадттдтстссддсдасстддтаатсдад лттсллтсстссслстлссстлссслслссстслсслтстссллслссстмтсстслсд 1461 цвегтгоацтугРго 5 ега 1 птьгьец 1 е 15 егдвпзе.ьечссегиадгр 11 с 1 иеестсрс 1 цтусрсовегс 1 птьсьецтьс 11 слвпеесьециесца 1 лср 370 ЭВО 390 аоо ао а 20 ддсассддссдадтсгстададдастсдссадсстсдддатааасдгсалсстастсдтс АепА 3 адэп 61 п 1 езегац усЬечзегаэоЬчу.уэча 161 у 3 едзпЬцЬц 1370 зео 390 4 ОО 4 В аго мстссмсслслтстстслсллсстслссслсстслмстссссл тамсстсстслтс Лвпееглвпс 1 п 11 зесс 1 цЬувЬец 5 егдврЬепЬувиа 101 у 11 дзпЬеиьец 1 е азо 440 450 460 470 400 дсакадассдаодтксатдстадасстаодтадсддтадстстсдссдастасссссс ТЬгс 1 увегапдера 1 учзЬцвегЬцдэрдзодвпдзрвега 1 па 1 пЬчргорго 4 ЭО 440 450 460 414 сво слсссслссслссллсссстлстслссстсслтслсллтслстстслсслтстссссссс 1 цс 1 уеесс 1 пб 1 ис 1 ура 1 ьаи 5 есьеиларларлаплврвесс 1 пильеирсорсо а 90 50 о 530 520 530 540 69 О 500 510 510 530 540 тасакддстдстдссааддсстакааасадсссдддсатсдасасслдстасадатто тлссссллстлстлсслсллсстсссссссслссссллсстслсслссласглссмстс ТУгс 1 Удаптугтуг 61 пдзгЬч 61 уаудвоаудеп 331 лгвдгцдэптугаэцсец ТУГС 1 УАВпТУТУС 61 плвпЬц 61 УС 1 УЛРС 1 УАвпиа 1 дседселапТУсС 1 иЬеи 550 560 57 о 500 590 600 550 560 570 564 590 600 ттКСДтоСтТСДДаДДачЛСДТССАСАааатССДаДССТДССТСДССаТССССДАСТСС т 353 СССТССТТСЛЛСЛЛССЛСЛТССЛТМССТТСЛСЛССТДССтСЛСССТСССТМСГСС ьецдАсуврьеьувьуздэоссеснеьувц 36 цтьгтугьечтьгуаА 3 вьуэсуо ьецл 1 асуарьеьуаьувлврссегв 1 еьузца 101 стьстусьецтьсиаэл 1 аьувсув 610 620 630 дасмотсдстоадсасслдстасдстстотАС дгрЬуееегЬец 01 чд 1 злзаузТЬгЬечзз 610 620 . 630 лссалстслстсслссссллстсслстстстм АСВЬУВ 5СЬаис 1 цл 16 АВПСуатЬГЬЕизведения в течение 3 часов при 37 С реакциигидролиза из реакционного раствора методом НГТ выделяют примерно 0,1 мкг фрагмента ДНК размером 2,7 Кв, содержащеготриптофановый промотор.Затем 0,01 мкг Нп 6 -Вап Н фрагмента (примерно 1200 вр), рЯО Н 11 В 9 и 0,05 мкгНп 6 -Вап Н-фрагмента(примерно 2,7 Кв,рСЕ растворяют в 30 мл раствора, содержащего 50 мМ трис-НС (рН 7,5), 10 мММцС 2, 10 мМ дитиотреитол и 1 мМ АТФ,после чего добавляют 6 единиц Т 4-ДНК-лигазы. Реакцию связывания проводят в течение 18 ч при 4 С,Используя полученный раствор, трансформируют штамм Езсйегс 3 а со НВ 101,получают Агп, колонию, иэ которой выделяют плазмиду ДНК рсэОН 11 С 2. СтроениереэОН 11 С 2 установлено расщеплением с помощью ЕсоЮ, Нп 6 И, Са, Вци Вап Ни электрофорезом на агароэном геле.П ри м Е р 7. Штамм ЕзтСИГС 3 а СО й3110 (ГЕРМ-В -732) трансформируют с помощью ре ком бинантной плазмидырЯОН 11 В 2 или ргэОН 11 С 2. Полученную А 63 колонию инокулируют в 8 мл питательнойМЦГ-среды (рН 7,2), содержащей 0,6 (3Йа 2 Р 04, 3 % КН 2 Р 04, 0,5лаС, 0,1МН 4 С, 0,5 Оглюкозы, 0,5казаминокислоты, 1 мМ М 9304 и 4 мкг/мл витамина В 1 и в течение 18 ч продолжают при 30 С куль тивирование, Бульон, содержащий культуру, центрифугируют 10 мин при скорости 8000 об/мин с выделением клеток, которые суспендируют в буфере Таепп и подвергают действию НДС в сочетании с электрофореэом на полиакриламидном геле с окрашиванием реактивом Сооаазве Вгапт голубым для обнаружения полипептидной полосы во фракции с молекулярным весом примерно 25000, В случае применения штамма Е. со 1, не содержащего плазмиду, укаэанная полоса не наблюдается. Тем самым подтверждено, что ЕэсЬ 1 гсЫа со 1, несущая рЯОН 1 В 2 или рЯОН 11 С 2, продуцирует в больших количествах полипептидный гормон роста лосося,с использованием обратной транскрипгаэы и мРНК в качестве матрицы,2. Способ конструирования промежуточной рекомбинантной плаэмидной ДНК, содержащей ДНК-фрагмент, кодирующий гормон роста лосося, для получения плазмид рЯОН 1, рЯОНЗ, рЯ 6 Н 6, рЯ 6 Н 9, рЯОН 10, рЯОН 14 и рЯ 6 Н 17, заключающийся в том, что получают векторный фрагмент путем расщепления рСОЧ 1 ДНК рестриктазой Крп 1, добавления олиготимидильных остатков к 3-концами расщепленной плаэмиды с помощью концевой деэоксинуклеотидилтрансфераэы. обработки рСОЧ 1 ДНК с олиготимильными остатками с помощью Есой 1 и выделения ДНК-фрагмента размером 3,1 кВ злектрофорезом, затем констрируют линкерную ДНК путем расщепления р 1 с помощью рЯг 1, добавления олигогуанильных остатков к 3-концам однонитевой р 1 с помощью концевой деэоксинуклеотидилтрансферазы, обработки р 11 ДНК с олигогуанильными остатками рестриктаэой Н 1 пб И 1 и выделения линкерной ДНК размером 0,5 кВ электрофореэом. далее получают кДНК, кодирующую гормон роста лосося, конструируют плаэмидную ДНК путем добавления олигомерных остатков к 3-концам, векторной затравки, имеющей двунитевую структуру мРНК-ДНК, с помощью концевой деэоксинуклеотидилтрансферазы, отжига ДН К векторный затравки, связанной с олигоцитидильными остатками с помощью Н 1 пб И 1, лигирования ДНК эатравочного вектора, расщепленного с использованием Н 1 пб Пи линекрной ДНК, спомощьюДНК-лигаэы изамены РНК-части в двунитевой структуре РНК-ДНК на ДНК с помощью ДН К-лигазы, ДН К-полимераэы 1 и рибонуклеазы И и отбирают целевую плаэмиду по способности гибридиэироваться с ДН К-пробой, имеющей следующую ДН К-последовательность известного гормона роста лосося,5 - ААА Т 6 ТТТААССАС ТТ(6) (С) Щ3. Способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК рЯ 6 Н 1 В 2, кодирующей гормон роста лосося. заключающийся в том, что осуществляют получение ДНК-фрагмента, имеющего й-концевой участок пептида путем обработки плаэмиды рз 6 Н 1 рестриктазами Яа 11, МЬо И, выделения ДНК-фрагмента, содержащего С-концевой участок 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 полипептидв в результате расщепления плаэмиды рЯ 6 Н 1 рестриктаэами Яа 1 1 и Ват Н 1, далее конструируют ДНК-фрагмент с триптофановым промотором путем расщепления плазмиды р 6 Е рестриктазами Н 1 пб Ии Ваа Н 1, синтезируют ДНК-линкер следующей формулы5 - А 6 СТТАТ АТА 6 ААААС - 3, 3 - АТА СТАТС ТТТТ - 5и лигируют полученные ДНК-фрагменты и ДНК-линкеры с помощью ДНК-лигаэы.4. Способ получения рекомбинвнтной плазмидной ДНК рЯ 6 НИ С 2, кодирующей гормон роста лосося, заключающийся в том, что получают ДНК-фрагмент, содержащий концевой участок полипептида путем расщепления плазмиды рЯ 6 Н 14 рестриктазвми МЬо И и РИЗ И, затем конструируют ДНК-фрагмвнт с С-концевым участок полипептида путЕм расщепления плазмиды рЯ 6 Н 14 рестриктазами РЧО И и Н 1 пб И 1, синтезируют ДНК-линкер с последовательностью5 - А 6 СТТАТ 66 ААААС - 33 - АТА СС 1 ТТТ - 5далее лигируют полученные ДНК-фрагменты с ДНК-линкером с помощью ДНК-лигаэы, получают ДНК-фрагмент полного полипептида гормона роста лосося путем обработки полученной рекомбинантной плазмиды с рестриктазамиН 1 пбИ и Вав Н 1, конструируют ДНК-фрагмент с триптофановым промоторором путем расщепления, р 6 Е 41 рекстриктаэами Н 1 пб И и Вагп Н 1 и получают целевую плазмиду связыванием ДН К-фрагментов с помощью ДНК-лигвзы.5, Способ получения рекомбинантного гормона роста лосося, заключающийся в том, что культивируют штамм ЕвсЬег 1 сйа соИ трансформированный рекомбинантной плазмидной ДНК рЯ 6 Н 182 или рЯ 6 Н 11 С 2 в питательной среде при 30 С в течение 18 ч с последующим выделением и очисткой целевОго продукта.