Способ радиометрического определения содержания фосфорибозилпирофосфата в биологических тканях

)5 0 01 й 33/6 ОБР ТЕН СКО ДЕТЕЛЬС А ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССРГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ(71) Омский государственный медицинскийинститут им, М,И.Калинина(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ФОСФОРИБОЗИЛПИРОФОСФАТА ВБИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЯХ(57) Использование: для определения содержания фосфорибозилпирофосфата в биол)гических тканях.,Сущность изобретения:для определения содержания фосфорибоИзобретение относится к аналитической биохимии и может быть использовано в экспериментальной и практической медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве.Целью изобретения является повышение точности анализа и сокращение времени егО выполнения,Способ осуществляется следующимобразом, Взвешивают порцию замороженной ткани 100 - 200 мг и быстро гомогенизируют в кипящем трис-НС буфере (30 мМ, рН 7,4), добавленном из расчета 1 мл на 100 мг ткани, Сразу же после этого две аликвоты гомогената по 0,5 мл переносят в пробирки, одна из которых содержит 0,5 мл 0,01 мМ водного раствора ФРПФ (служащего стандартом), а другая - 0,5 мл дистиллированной воды. Обе пробирки нагревают на кипящей водяной бане в течение двух минут, после чего, немедленно охлаждают до 0 С, Охлажденные пробы центрифугируют при О - 4 С и 10009 в течение 1 мин, после чего каждый иэ супернаэилпирофосфата проводят реакцию ферментативного синтеза инозинмонофосфата из меченного гипоксантина в присутствии и отсутствии стандарта фосфорибозилпирофосфата, инозинмонофосфата осаждают в виде соли лантана, которую затем растворяют в 0,03 М соляной кислоте, смешивают с сцинтилляционной жидкостью и измеряют скорость образования в ней импульсов, Изобретение позволяет повысить точность анализа фосфорибозилпирофосфата и сократить затраты времени на его выполнение эа счет селективного выделения продукта реакции и определения его радиоактивности в гомогенной счетной системе. тантов смешивают с 1 мл 20 Мм раствора М 9 С 2, содержащего меченный гипоксантин в концентрации 0,025 мМ и инкубируют при 37 С в течение 90 мин, Реакцию останавливают охлаждением пробирок до О С и добавлением охлажденных реактивов: К-фосфатного буфера(0,06 М, рН 7,4) - 1 мл трис-НС буфера (0,1 М, рН 7,4) - 6 мл, и 0,5 М водного раствора азотнокислого лантана - 1 мл, Осаждают иноэинмонофосфат при 0 С 15 минут, после чего, центрифугируют в течение 10 минут при 0 С и 30009. Полученные таким образом осадки растворяют в 2 мл 0,03 М НС), отбирают от каждого раствора по 0,6 мл и смешивают с 10 мл сцинтилляционной жидкости Брея, Скорость образования импульсов измеряют на сцинтилляционном счетчике бета-частиц.Содержание ФРПФ (в мольг сырой ткани) рассчитывают по формулеС 100Сст С1802335 ной жидкостью Брея, Скорость образования импульса в каждой пробе измеряли в течение одной минуты на счетчике СБС.Получили значения: для пробы содержащей стандарт Ф РПФ - 158294, импульса, для пробы без стандарта - 12337 импульсов, Подставив эти значения в формулу, получили 12337 100 158294 - 12337Составитель П,ЗолинРедактор В.Трубченко Техред М,МоргенталКорректор М.Самборская Заказ 847 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-иэдательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 где Сс - счет пробы содержащей стандарт ФРПФ;С - счет пробы не содержащей стандарт ФРПФ,П р и и е р (определение содержания 5 фосфорибозилпирофосфата в крысиной печени).Взвешивали 150 мг замороженной в жидком азоте крысиной печени, быстро переносили в гомогенизатор и добавляли 1,5 10 мл трис-НО буфера (30 мм, рН 7,4), предварительно нагретого до кипения, Гомогени-. зировали в течение 15 с. Две аликвоты гомогената по 0,5 мл немедленно переносили в стоящие на кипящей водяной бане про бирки, одна из которых содержала 0,5 мл 0,01 мМ водного раствора ФРПФ, а другая - 0,5 мл дистиллированной воды. После добавления гомогената обе пробирки кипятили в течение 2-х мин и немедленно помещали в 20 лед. Охлажденные пробы центрифугировали при 0 С и 1000 в течение одной минуты, послечего супернатанты сливали в отдельные пробирки, а осадки отбрасывали. К обоим супернатантам добавляли гр 1 мл 20 мМ оаствора МдО 2, содержащего С-гипоксантин в концентрации 0,025 мМ и инкубировали на водяной бане при 37 ОС 90 минут. Затем, обе пробирки помещали в лед и в каждую из них добавляли по 1 мл 0,06 мМ К-фосфатного бу фера (рН,4), по 6 мл (0,1 М трис-НС 1) буфера (рН,4) и по 1 мл 0,5 М водного раствора азотнокислого лантана. Добавленные рас- творы были предварительно охлаждены до 0 С. Пробирки встряхивали и помещали в 35 лед на 15 минут, после чего центрифугировали 10 мин при 0 С и 30000. Супернатанты отбрасывали, а к осадкам добавляли по 2 мл 0,03 ЬГ раствора НО и растворяли их при встряхивании, Из каждого раствора брали 40 по 0,5 мл и смешивали с сцинтилляционТаким образом, во взятом образце печени содержание ФРПФ составляет 8,45 нмоль г сырой ткани.Средняя продолжительность анализа по прототипному способу составляет 8 ч 45 мин, по предложенному способуч 30 мин величина среднего квадратического отклонения - соответственно 0,458 и 0,255 нмоль/г,ФТаким образом, использование предлагаемого способа позволяет повысить точность анализа в 1,8 раза и сократить затраты времени на его выполнение в 3,5 раза,Формула изобретения Способ определения содержания фосфорибозилпирофосфата в биологических тканях, включающий проведение реакции ферментативного синтеза инозинмонофосфата из меченого гипоксантина в присутствии и отсутствии стандарта фосфорибозилпирофосфата, выделение меченого инозинмонофосфата и измерение его радиоактивности, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения и повышения точности способа, иноэинмонофосфат, выделяют осаждением раствором азотнокислого лантана, осадок соллюбилизируют 0,03 М соляной кислотой, смешивают с сцинтилляционной жидкостью и затем измеряют в ней радиоактивность.