Способ получения туберкулина

ОП ИОАН Союз Советских Социалистических Республик(31) 34644/73 28.0 оарАвратванныв наннтвтСоната Мнннатров СССРоа долам нвобрвтаннйн отнрытнй(72) Авторы изобретени Иностранная фирма Мицуи фармасьютикалз, Инкорпорейтед1) Заявител спОсОВ пОлучения туБеРкулит(А кислотами, предпочтительно ацетоном,метанолом или уксусной кислотой, Этирастворители можно использовать вместе с водой, Клетки, обработанныерастворителем, подвергают варке снуклеазами, например с рибонуклеазами, дезоксирибонуклеазами. Водорастворимые белки выделяют из полученнойсмеси и подвергают диализу с применением буферов с рН 5,5-7,8, например,буфера (рН 7,0), содержащего трис.(оксиметил)-аминометан и хлористыйводород, а также зтилендиаминтетрауксусную кислоту (рП 7,2), динатрийфосфат, монокалийфосфат,обамые моносия белк тем отд от жид вора и з ости автол воримых нтриров вания. беспечи левого иза ст мо и Фракционируютфьльтрованиемительнее хромас применениемзы или фильтро рименением мосстранового поирования диализабменную целлюлозу еллюлозу, диэтиллюлозу, триаминоу или эпихлоргид- ХТЭОЛА)-целлюлоДиализованные белхроматографией и/илчерез гель пред,очтография на колонкеионооьменной целлюлвание через гель стиковидносшитого делимера, Для фракциотов используют иононапример, аминозтиламиноэтил (ДЭАЭ)-целэтил (ТАЭ) -целлюлозринтриэтаноламино (зу. телемклетштаммйствию рафичес- продукт ющим о ИусоЬас - абатывают ми, напри- арбоновыми Изобретение относится к спо получения чистых белков, кото гут быть использованы для диа тики туберкулеза. Известен способ получен туберкулезных бактерий пу ления бактериальной массы добавления буферного раст органических растворителей бактерий, отделения нераст продуктов автолиза и конце препарата при помощи упари.Однако такой способ не о высокой степени чистоты це продукта. С целью повышения степени,ч целевого продукта по предлага способу органическим раствори обрабатывают инактивированные ки русоЬасегСотп ЫЬегсоРозКа Аод 4 амай В и подвергают их де нуклеазы, а фильтрат хроматог ки очищают и выделяют целевой кристаллизацией. Способ осуществляют следу разом,Инактивиров Вез"сотп ЬзЬа р с с органическими я мер, кетонами кДиализованные белки элюируют буферными смесями.Кристаллические туберкулиновые белки растноримы н воде, их молекулярный вес составляет 3000-3500 в зави 5 симости от клеток, применяемых для их получения. Кожные пробы на туберкулин показывают, что туберкулиноные белки обладают активностью в 10- 100 раз превышающей активность очищенных производных белков (ОПБ) на морские свинки, сенсибилизированные штаммом Аойама В или бациллой Кельметта Герена (БКГ), инактивиэированных термообработкой микроорганизмов вида МцсоЬас 1 еготл 1 оЬегсоЕоыв,15Туберкулиновые пептиды получаютгидролизом кристаллических туберкулиновых белков, фракционированием гид,ролизатов этих белков хРоматогРафией 20или Фильтрованием через гель.Туберкулиновые белки подвергаютгидролизу химическими или ферментатинными способами, Химический гидролизпроводят с помощью минеральных кислот, а ферментатинный с применениемпротеолитического фермента, например,трипсина, химотрипсина, пепсина,папаина, бактериальных протеиназ,карбопептидаз Ли Ь. 30Полученные гидролизаты фракционируют хроматографией на колонке, бумажнойхроматографией, высоковольтным бумажным электрофорезом, фильтрованиемчерез гель. Фильтрование через гельосуществляют с применением аммониевоацетатного буфера (РИ 5,9) черезСефадекс -25 или КМ-Сефадекс, пиридино-ацетатного буфера 40(РИ 3,1),Туберкулиноные пептидь представляютсобой белые кристаллы, Растворимые 40н ноде, с молекулярным весом 5003000. Кожные пробы на туберкулин показывают, что туберкулиновые пептидыобладают более высокой, чем ОПБ, активностью, на морские свинки, сенсибилиэированные штаммом Аойайа В илиБКГ, микроорганизмов МцсоЬас 1 ег(итпФи Ьегсо Зов(6 инактивированных термообработкой.П р и м е р 1, Культивированные6 клетки (100 г) штамма Аойама В Мц -со Ь с с с е ги тп С и Ь е,г с о 1 о зз инактивируют термообработкой при 120 С в течение 30 мин, Клетки выделяют из культуральной среды фильтрова ф нием, затем их разрывают посредством звуковой обработки и обрабатынают ацетоном. Полученный остаток подвергают варке с рибонуклеазой и дезоксирибонуклеаэой, и вываренную смесь 68 центрифугируют для отделения водорастворимых белков. Полученные водоРастворимые белки диализуют с применением 0,001 М раствора буфера натрис-(оксиметил) - аминометане и хлористом водороде (РП 7,0), содержащего0,0001 М растнор этилендиаминотетрауксусной кислоты,Полученный диализат хроматографируют на ДЭАЭ-целлюлозе. Элюированиепроводят в среде, содержащей хлористый натрий. Весь активный туберкулицсодержится во второй белковой фракции.Последующую хроматографию на Сефадексе 6- 200 проводят аналогично, ипродукт фракционируют на три фракции.Весь активный туберкулин содержитсяв большей фракции,Активный туберкулин,кристаллизуетсяспонтанно при выдерживании растворапри 4 фС в смешанном растворе тогоже буФера с очищенным ацетоном. Из100 г клеток (мокрый вес) штаммаАойама В микроорганизма вида МусоЬасИ отп оЬегси Говеть получают 25 мгкристаллического туберкулиноного белка.Туберкулиновый белок, полученный поэтому способу, состоит из 89 остатков аминокислот, расположенных в следующем порядке:1 е 3 4 5 НеХ -АРг -Лей -дец -Аей- ,0 й 6 7 8 9 10 ЪЛ-Иее - .Ала -Лнз - СООНКожная проба на туберкулин показывает, что полученный туберкулиновыйбелок обладает активностью в 100 разпревышающей активность ОПБ на морские свинки, сенсибилизированные штаммом Аойама В или ГКГ, инактивированных термообработкой,П р и м е р 2. Получают белок сактивностью туберкулина, с молекулярным весом д 13 500 из ГКГ по методике,описанной в примере 1.Порядок расположения аминокислотэтого туберкулинового белка, состоящего из 135 остатков аминокислот: К-концевые и С-концевые аминокислоты, атакже первичная структура в основномтакие же, что и у белков штамма Аойама В, инактивированпых термообработкой.Кожные пробы на туберкулин показывают, что активность этого туберкулинового белка почти соответствует активности белка из штамма Аойама В,инактивированных термообработкой;микроорганизмов М ц сцЬасЕг о тв Ео582745 Формула изобретения. Составитель С, Малютина Техред А.Богдан Корректор А. Лакида Редактор Н. Хубларова Заказ 3645/713 Тираж 677 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 исЛм(а на морские свинки, сенсибилиэированные инактивированными термообработкой шФаммами Аойама В или ГКГ.П р и м е р 3. Кристаллический туберкулиновый белок, полученный по методике примера 1, подвергают ферментативному гидролизу при 37 фС в течение 6 ч с применением 1-ного раствора три сина при рл 8,4. Двухраэмерный высоковольтный бумажный электрофорез полученного гидролизата проводят при 75 В/см в пиридино-ацетатном буфере (рН 4,5), после чего хроматографируют на бумаге в смеси бутанола, уксусной кислоты и воды ( 4 : 1 ; 4 по объему),Проявление приводит к отделению некоторых активных пептидов, один из которых представляет собой пентапептид со следующим порядком расположения аминокислот: 1 3 Ф 5 Кф-Асп-Глц-Свр-Глу-Мея-Сооп.Выделен также нонапептид с молекулярным весом 950. 25Кожные пробы на туберкулин показывают, что активность этих туберкулиновых пептидов составляет 1-10 по отношению к активности исходного туберкулинового белка. 30П р и м е р 4. Кристаллическиг туберкулиновый белок, полученный по методике примера 1, подвергают гидро- лизу в 0,5-ном растворе химотрипсина, Полученный гидролиэат хроматографируют на колонке, заполненной Сефадексом Ь, причем элюирование проводят аммониевоацетатным буфером при рН 5,9. Полученные пептиды с активностью туберкулина затем фракционируют пиридинацетатным буфером (рН 3,1) на колонке, заполненной довексом 1-Х 2. Полученный туберкулиновый пентапептид имеет такую же структуру, как пептид, полученный по методике примера 3.П р и м е р 5. Туберкулиновый белок, полученный по методике примера 2, обрабатывают, аналогично примеру 4. Получают такой же туберкулиновый пентапептид, как полученный по методике примера 3. Способ получения туберкулина путем обработки клеток МцсоЬасСеф шп 1 Ш)е со 1 оыь органическим растворителем, а затем ферментом, отделения нерастворимых примесей и выделения целевого продукта из фильтрата, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения степени чистоты целевого продукта, органическим растворителем обрабатывают инактивированные клетки Иусо - Ьас 1 е.мти СоЬа сибоабэ штамм Аойама В и подвергают их действию нуклеазы, а фильтрат хроматографически очищают и выделяют целевой продукт кристаллизацией.