Способ получения оксикислот или их лактонов

З СОВЕТСКИЦИАЛИСТИЧСПУВЛИК 4 С 12 Р 1/02//А 61 К 35/70 (С 12 Р 1 02 С 12 К 1:66 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ ЗОБР ЕНИЯ ОПИСАН ПАТЕНТУ 2935800/30-15.13,06.807780721. 09. 79(СН), Генри Йошуа,Лопез и Карл Х:Хоффма779.932 (088.8)СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОКСИЛАКТОНОВ общих формулО Т 0 ОН СНз путем фермен штаммом Азре У 20542 с по ьной средоз АТССелением у ции питат 111 оз сег ванных соедин смеси экстраг леми последов следующим(72) Рич В. Альбе Сконберг Марин Б, (53) 615 (54) (57) ИЛИ ИХ й из ферментацион ванием растворите ельной хроматографи1253432 2ществ, обладающих гипохолестеремической активностью, общих Формул О сй ОО ОН Эти соединения подавляют биосин 7 ез холестерина и могут быть использованы для лечения атеросклероза, гиперлипемии и других подобных заболеваний, а также в качестве противоплесневых агентов.Оксикислоты или их лактоны полу- зО чают путем Ферментации питательной среды штаммом Аврег 11 пв еггецв АТСС У 20542 с последующим выделением соединений из ферментационной . смеси экстрагированием Растворителем 35 и последовательной хроматографией.Штамм АврегдьПпв сеггеы (обозначенный МР) в собрании культур (Фирма Мерк энд Ко Инк Ревей, Нью-Йорк) помещен на постоянное хра 40 нение в коллекцию Американского Собрания Видов Культур, 12301, Парк " лун Драйв, Роквилл, Мэриленд 20852 и получил номер по каталогу АТСС У 20542.Морфологическая характеристика микроорганизмов АТСС У 20542 аналогична морфологическим характеристикам рода АврегяП 1 цв, В результате сравнения с известными видами уста 5 новлено, что штамм принадлежит виду Аврегд 11 цв еггецв. 25 а этого штамх соединендной средедругих продя среда соазота и н Выращиваниолучения нов обычнойктов Ферржит источ- рганичесствляется в для получения ментации. Так ники углерода Изобретение относится к способуполучения новых лекарственных векие соли, которые устаиваются микро-,организмами.Углеводы, такие как сахара, например глюкоза, фруктоза, мальтоэа,сахароза, ксилоза, манитол и т,пкрахмалы, такие как крахмал зерна,например овса, риса, кукурузный крах.мал, кукурузная мука крупного помола и т.п., можно использовать, какпо отдельности, так и в комбинации,в качестве источников усваиваемогоуглерода в питательной среде, Точноеколичество источника или источниковуглеводов, которое используется всреде, зависит частично от другихингредиентов, содержащихся в среде,но в общем случае количество углеводов обычно варьируется в пределахот 1 до 6 вес,7 среды. Источникиуглерода можно использовать по отдельности или несколько таких источников углерода используется в комби"нации. В качестве источников азотав процессе Ферментации можно использовать протеиновые материалы, Ксоответствующим источникам азота относятся, например, гидролизаты дрожжей, первичные дрожжи, мука крупногопомола соевых бобов, мука семян хлопка, гидролиэаты казеина, насыщенныйликер кукурузы, растворимые веществаиз дистиллятора или томатная паста ит;и. Источники азота используютсялибо по отдельности, либо в комбинации в количествах от 0,2 до 6 вес.йот веса водной среды,3 12534К питательным неорганическим солям, которые можно использовать в среде для выращивания культуры, относятся обычные соли, содержащие натрий, калий, аммоний, кальций, фосфат, 5 сульфат, хлорид, карбонат и другие подобные ионы, Они также могут содержать следы металлов, таких как кобальт, марганец, железо и магний,Ферментация осуществляется при 1 О 20-37 С, Однако с целью получения оптимальных результатов ферментация осуществляется при 22-30 С. рН питательной среды, предназначенной для культивирования Аэрег 8111 цэ и получения новых соединений, может варьироваться от б,0 до 8,0.Хотя новые соединения выра. батываются культурой как на поверхности, так и в погруженном состоянии, про цесс ферментации осуществляется в погруженном состоянии. В небольших масштабах ферментация в общем случае осуществляется при помощи внесения на соответствующую питательную сре ду культуры Азрег 811 пз и затем, после переноса питательной среды с привитой культурой в среду для продуцирования, ферментация осуществляется при постоянной температуре около 28 С в течение нескольких дней при периодическом встряхивании. Соединения ТТ 1 и ТЧ (особенно 111) можно выделить известным спо" собом без использования хроматографии в форме солей аммония, Такой способ выделения является более удобньм и гораздо больше приспособлен для промьппленного использования, чем хроматография. Кроме того, соли соединения Т 11 и ТЧ являются гораздо более активными, чем соединения 1 и 11 в реальных условиях с целью ингибирования процесса биосинтеза холестерина и в качестве протиФерментация инициируется в стерилизованной колбе со средой при помощи одной или нескольких стадий 35 развития семян. Питательной средой для стадии семени может быть любая подходящая комбинация источников%углерода и азота. Колба с семенами выдерживается в камере при постоян ной температуре около 28 С в течение двух дней при периодическом встряхивании или до тех пор, пока рост не достигнет удовлетворительного уровня и часть полученной в ре зультате для прививки потомства второй стадии или среды для продуцирования. Колбы с потомством промежуточных стадий, если таковые используются, культивируются по существу 50 тем же способом, т.е. часть содержимого колбы со стадии последнего потомства используется для прививки среды для продуцирования. Колбы с привитой культурой встряхиваются 55 при постоянной температуре в течение нескольких дней, а в конце.периода инкубирования содержимое колб 32 4подвергается центрифугированию илифильтруется,Для реализации в более значительных масштабах ферментация осуществляется в подходящем резервуаре,снабженном мешалкой и средствами дляаэрации средь 1 Ьерментации. В соответствии с предлагаемым способомпитательная среда загружается в резервуар и стерилизуется при помощинагревания примерно до 120 С. Послеохлаждения стерилизованная средапрививается предварительно выращен-ными семенами (потомством) продуцирующей культуры и процесс ферментации продолжается в течение, например, 3-5 дней. Одновременно осуществляется перемешивание и/или аэрацияпитательной среды и поддерживаетсятемпература примерно 28 С. Этот способ биосинтеза новых соединенийпредназначен, в частности, для получения больших количеств.Соединения известным способомвыделяются иэ бульона для ферментацииСоединения 1 и Т 1 можно подвергнуть гидролизу с основаниями,такими как ИаОН, чтобы получить соли, такие как соли натрия соединений 111 и 1 Ч, Используя основания сдругими приемлемыми с фармацевтической точки зрения катионами, можнополучить соли этих катионов. Аккуратное подкисление солей дает оксикислоты 111 и 1 Ч, которые можнопревратить в соединения 1 и 1 Т прикислотных значений рН. Обрабатываясоединения 1 и 11 при помощи кислотного или щелочного катализа сметаллометанолом, этанолом, пропанолом или бутанолом, или с фенил, диметиламино или ацетиламино алканолами, получают соответствующие сложные эфиры соединений 111 и 1 Ч.1253432 5воплесневых агентов. В действительности, оксикислоты (и их соли) являются активными формами. Следовательно, такие соли являются более предпочтительными, в частности, нри использовании в Форме доз. Кроме солей аммония; являются и соли тетраметнл" аммония и соли этилендиамина, натрия, калия, кальция, И-метилглюкамина, лйзина, аргинина и орнитина.Указанные соединения являются Фармакологически активными соеди" нениями и могут применяться как ле" карствекные препараты стоматическим или нарентеральным способом в Форме капсул, таблеток, инъекций и т.п. Б общем случае используется стоматический способ применения, Дозы можно варьировать я зависимости от возраста, степени заболевания, веса тела и других Факторов человека, но ежедневная доза для возрослого паРциента содержится в области пример" но от 2 до 2000 мг(в предпочтитель,ном варианте 2-100 мг), которая может быть разделена на две - четыре отдельные дозы, При необходимости можно использовать и более высокие дозы.Соединения можно также исполь зовать в качестве противоплесневых агентов.П р и м е р 1. Ферментация.1 ообирка с лиофилизованной культурой Азрег 811 цз етгепз АТСС У 20542 открывается в стерильных условиях и содержимое суспендируется в 250 мл колбу Зрленмайера без перегородки (семенная колба 1), содержащую 40 мл среды С, которая имеет следующий состав, г:Насыщенный кукурузный ликер 5Томатная паста 40Овсяная мука крупного помола 10Глюкоза 10Среды элементов смеси ъ 2 10Дистиллированная вода 1000 млрН 6,8 при помощи ИаОН. Колба с привитой культ 5 рои инкубируется в течение 24-48 ч при 28 С на вибраторе, совершающем 220 кол./мин (размах илц амплитуда 5,08 см), Часть (примерно 0,5 мл) содержимого этой колбы затем используется для прививки культуры и наклонной пробирке, содержащей среду Е, Среда Е имеет следующий состав, г;Зкстракт дрожжей 4Солодовый экстракт 10 Декстроза 4Агар 20Дистиллированная вода 1000 млрН 7,0 при помощи ИаОН.Наклонная пробирка с привитойкультурой инкубируется в течение11 дней при комнатной температуре.Затем она хранится при -60 С в течение 3-4 мес. Часть содержимого этой 10 пробирки затем суспендируется в250-миллилитровую колбу Зрленмайерабез перегородки (семенная колба 2),содержащую 40 мл среды С. Колба спривитой культурой инкубируется в течение 24 ч при 28 С на вибраторе,совершающем 220 кол./мин (размах,5,08 см), Приготавливаются шестьколб Эрленмайера емкостью 250 млбез перегородки, содержащих 40 млсреды С. Затем в каждую колбу прививается культура при помощи 2 млна каждую колбу содержимого семеннойколбы 2. Зти шесть колб инкубируютсяв течение 48 ч при 28 С на вибрато ре, совершающем 220 кол./мин (размах 5,08 см). Затем берут шесть двухлитровых колб Зрленмайера, содержащих среду Р в объеме 500 мл, и вкаждую колбу прививается культурапри помощи содержимого семенной колбы 3, Среда Г имеет следующий состав, г:Насыщенный кукурузный 15Крахмал СРС 20Кукурузная мука грубого помола 1 35Лзмельченные соевые бобы 4Глюкоза 5Соевое масло 2,5(ИН,), ЯО 440 КН 2СаСО, бДистиллированная вода 1000 млЯ при помощи ИаОН.Колбы с привитой культурой инку бируются в течение 11 дн. без перемешнвания при 28 С. После инкубирования в течение 11 дн. бульон подвергается экстрагированию.Экстрагирование . 50Весь бульон рн 6,0 смешиваетсяв смесителе Баринга с тем, чтобыразбить тяжелый слой мицелия, центрифугируется и прозрачный верхнийслой декантируется. После Фильтрации 10 л Фильтрата экстрагируетсяпри помощи 3 л этилацетата, в результате чего получается 1820 мл прозрачного экстракта, Второе экстраги1820 3350 2100 45 50 бщая ак ивность содертверчастиц,10627110996802103":7 89 7879 рование при помощи 3 л этилацетата дает 3350 мр прозрачного экстракта Твердое вещество бульона экстрагируется при помощи перемешивания в течение 1 ч с использованием 2 л метанола и после фильтрации получается 2100 мл фильтрата.Порции этих экстрактов сушатся и направляются для анализа, Фильтраты испытываются как ингибиторы Фермента редуктазы НМС-СоА методом, описанным Бегом, Стоником и Бревером. При этом используются Ферменты, полученные в соответствии с описанием, приведенным Клейнзеком, Рангатамом и Портером. Положительный тест - ингибирование составляет более 907 при 20 мкгмл 1 С составляет 2,3 мкг/мл, что указывает на присутствие очень сильного ингибитора синтеза холестерина, действующего на содержание редуктазы НМС-СоА.Результаты анализа экстракта приведены в табл.1.Т а блица Гель-фильтрация.Весь твердый материал, полученный из первых двух экстрактов, соединяется вместе, растворяется в метаноле и Фильтруется с целью удаления нерастворимых твердых частиц,130 мл фильтрата загружается вколонку для гелевой фильтрации , (2,5200 см, 980 мл), заполненную материалом Сефадекс ЕН, и проба фракционируется в соответствии с размером молекул при помощи метанола который используется в качестве растворителя. Используя индекс преломляемости и данные Уф-анализа, наилучшие фракции определяются при помощи биоаналнза (см.табл.2).Таблица 2 1 О 15 20 25 30 35 Выделение и очистка,Проба из фракции 2 предварительнофильтруется через слой в 1 г материала Уотерс Бондапак С 18 /Поразил В и элюируется пятью объемамиметанола. Метаноловый элюат концентрируется до съема 0,5 мл. эта проба подвергается хроматографии несколько раз на материале Уотерс С 18, .из которого изготовлена колонна(3,9 мм 20 см), причем в качествепроявляющего растворителя используется смесь метанол: 0,05 М растворфосфата аммония, рН 2, 9, (75," 25).Фракции исследуются на спектрофотометре Бекмана и те фракции, для которых максимум поглощения соответствует 236 нм с изгибами в 229 и245 нм, соединяются и концентрируются при пониженном давлении до водного раствора. рН концентрата довогчт"ся до 6,5 при помощи 2 М растворагидрата окиси калия и активные компоненты экстрагируются этилацетатом.Органический слой сушится, концентрируется до сухости и остаток растворяется в 0,3 мл метанола. Метаноловый раствор подвергается хроматографии и рециркулируется. Фракции,содержащие ранее элюированную компоненту, соединяются, концентрируютсядо водного раствора и зкстрагируются хлороформом. Остаток из хлороформа помещается в метанол и растворитель выпаривается в атмосфере азота,3,5 мг высушенного продукта, полученного таким образом, идентифицируется как оксикислота (соединение 111),фракции, содержащие вторуюкомпоненту, соединяются и экстрагируются хлороформом. Получено 0,87 мгвысушенного продукта, который идентиФицирован как лактон (соединение 1). Физико-химические свойства соединения 1 (Г 1 БЭ) приведены ниже; т,пл. 170-171 С, молекулярный вес (масс-спектроскопия) 404, Формула - С,Н 2 О (найдено при помощи масс- спектроскопии 402,555, рассчитано 404, 2563), УФ-спектр (в ацетонитриле), нм: 230,5 с Е% 505,7, 237,5 с Е 7, 576,6; 246 с Е 7 395,2.С. ЯГ 1 Р химические сдвиги. Спектр получен в растворе СОС 1 (20,1 мг в 0,35 мл). Химические сдвиги приведены относительно внутреннего тетраметилсилана при нуле ррм , при1253432 Сост ение В/ кони для ферментации и емкостью 200 485 л среды, 5 вес/об пе ка 2,5 Х вес/о из нержага (757 л одержащей тонизироцеллюлозы 4, ванного мало ауто 9экспериментальных условиях импульс ,растворителя (СВС 1 ) имеет место в области 70, 0 ррм (долей на миллион). Обнаружено 24 атома углерода, что согласуется с данными масс-спектроскопии, они имеют следующие химические сдвиги, ррм: 11,5, 13,6; 16,0;22,6; 24,1; 26,6; 27,2; 30 у 5; 32,5;131,7; 133,2; 170,8 и 177,2.Оптическое вращение.Характерное оптическое вращение с 31, = 320,7 определяют на растворе 5,30 мг/мл СН,СИ, Это значение получено при помощи измерения длины волны линии натрий-П.На основе этих и других данных можно предположить, что продукт имеет следующую химическую стерео- структуру 3тствующая оксикислота (сое) имеет структуру П р и м е р 2. Пробирка с лиофилизованнойкультурой Авреха.Пцз сеххепз АТСС Р 20542 открывается в стерильных условиях и содержимое суспендируется в 250-миллилитровую колбу Эрленмайера без перегородок (семенная колба), содержащую 40 мл среды С Колба с привитой культурой инкубируется в течение 30 ч при 28 С на вибраторе, совершающем 220 кол./мин (размах 4,08 см), В 250-миллилитровую колбу Эрленмайера без перегородки, содержащую 40 мл среды С, прививается культура при помощи 2 мл на колбу содержимого семенной колбы. Среда С имеет следую щий состав. Декстроза 45Петонизированное молоко 24Аутолизированные дрожжи 2,5Полиголиколь Р 2000 2,5 млДистиллированная вода 1000 млрН 7,0 при помощи БаОН,Колба с привитой культурой инкубируется в течение 120 ч при 28 С навибраторе,совершающем 220 кол./мин1 О (размах 5,08 см). После 120 ч инкубирования содержимое колбы подвергается экстрагированию в соответствиис процедурой из примера 1. Общаяпроизводительность составляет 2115 500 ед./мл.П р и м е р 3. Ферментация. Про"бирка с лиофилизованной культуройЛТСС Ф 20542 открывается в стерильных условия и содержимое суспенди 2 р руется в 250 мл колбу Эрленмайерабез перегородки (семенная колба),содержащую приблизительно 10 мл среды, которая имеет следующий состав,гНасыщенный кукурузный ликер 525 Томатная паста 40Овсяная мука грубого помола 10Глюкоза 10Раствор следов элементов 10Дистиллированная вода 1000 мл рН 6,8 обеспечивается при помощи ЫаОН.Раствор следов элементов, мг: Геа 04 7 Н 2 О 1000ИпБО 4 Н О 1000СпС 1 2 Н 0 25СаС 1, 2 Н,О 100Нз ВОз 56(БН ) 6 Мо 704 Н О: 192 ПЯОл 7 Н 20 200Дистиллированная вода (де зированная) 1000 мКолба с привитой культурой инкубируется в течение 24 ч при 28 С на вибраторе,совершающем 220 кол./мин (размах 5,08 см), Затем в двухлитровую колбу Эрленмайера без перегородки, содержащую 500 мл среды,прививается культура при помощи 10 мл Осодержимого первой стадии ферментации из семенной смеси. Эта колба также находится на вибраторе в течение 24 ч при 28 С.В бак5 веющей стал )загружается11 1лизованных дрожжей 0,25 вес(об., полигликоля Р 2000 025% об(об, рНсреды доводится до 7,0. Содержимоестерилизуется в течение 15 мин при121 С, Затем в бак заливается одинлитр содержимого со второй стадиии смесь инкубируется на вибраторе,совершающем 85 кол,/мин, в течение12 ч, затем на вибраторе, совершающем 130 кол./мин в течение 84 ч при28 С при подаче воздуха со скоростью5 0,142 м/мин в течение 12 ч, а затем со скоростью 10 0,34 м /мии втечение 84 ч,Экстрагирование.Соединяются две одновременно загружаемые порции в сто гал (378 л)бульона, подкисляются при перемешивании до рН 4, 1 при помощи аккуратного добавления 800 мл концентрированной соляной кислоты и экстрагируются добавлением 75 гал (284 л)этилацетата, затем перемешиваниепродолжается в течение 2 ч,Затем добавляется примерно 25 футов (11,34 м кг) кремнистого вспомогательного фильтрующего материалаи весь полученный шламм пропускаетсячерез 61 см фильтр-пресс. Дополнительно 75 гал (284 л) этилацетатаиспользуется для промывки спрессованной лепешки и продолжения экстрагирования при помощи обращения направления подачи этилацетата черезпресс. Эта процедура осуществляетсячетыре раза. Затем весь промывочньйрастворитель сливается из пресса исоединяется с первым фильтратом.Двухфазной смеси (фильтрату) даютвозможность отстояться и водный слойудаляется. Слой этилацетата промывается.при помощи 10 гал (37,85 л)деионизированной воды, фазам даютвозможность разделиться и экстрактыэтилацетата концентрируются под ва =куумом до примерно 10 гал (37.85 л).Лактонизация,Для того, чтобы осуществить циклизацию любого соединения 1 Ч в экстракте в соединение 11 производится следующая азеотропная обработка.Экстракты этилацетата из дополнительных 300 гал (1135,5 л) бульона добавляются в экстракт и объем снижается до примерно 30 гал (113,5 л) бульона добавляются в экстракт и объем снижается до примерно 30 гал (113,5 л) при помощи вакуумной253432 12 15 20 25 30 35 40 45 50 55 дистилляции. Добавляется примерно50 гал (189 л) толуола и содержимоеконцентрируется под вакуумом дообъема 32 гал (121 л), эта стадияповторяется. Затем добавляется достаточное количество нового толуола,чтобы довести объем до 75 гал(284 л). Без использования вакуумасодержимое доводится до дефлегмирования и это состояние поддерживается в течение 2 ч при температуре более 106 С.Этот раствор далее концентрируется под вакуумом до небольшого объема, который затем концентрируется до маслянистого остатка в большом роторном испарителе под вакуумом.Хроматография на силикагеле.Полученные экстракты освобождают"ся от других растворителей добавлением 2 гал (7,5 л) метиленхлорида и повторной концентрацией до масла.Маслянистый остаток растворяется примерно в 5 гал (18,9 л) смеси зтилацетат-метиленхлорид (3070 об./об), а затем приготавливается шламм при помощи добавления 2,8 кг силикагеля.Шламм наносится ровным слоем на верхнюю часть колонны из силикагеля с размерами 30,5 см 127 см, заполненную той же смесью растворителей. Элюирование производится смесьюэтилацетат-метиленхлорид(37,85 л), затем собираются фракциикаждая объемом в 4 гал (15,141 л).Фракции от 6 до 10 включительноконцентрируются под вакуумом до маслянистого остатка, который растворяется в горячем этилацетате, обрабатывается обесцвеченным углеродом,фильтруется пока горячий и затем охлаждается. Кристаллы ИЯЭ 803 (соединение 1) выделяются фильтрацией,а маточные растворы концентрируютсядо масла и подвергаются хроматографии,Повторная хроматография на силикагеле.Остаточные маточные растворы иэодного и того же экстракта бульона,эквивалентные по производительностидополнительным 600 гал (2271 л)сырья для ферментации, соединяются всоответствии с приведенным в растворе метиленхлорида. Половина этогораствора используется для дальней13 1шей хроматографии на силикагеле, Исследование небольшой порции показывает, что общее содержание твердыхчастиц составляет 325 г. Раствор обрабатывается 40 г обесцвеченного углерода, фильтруется .и лепешка промывается метиленхлоридом, Соединенные фильтрат и промывочные растворыконцентрируются пад вакуумом до маслянистого остатка. Остаток вновьрастворяется в 800 мл смеси этилацетат-метиленхлорид (30-70 об./об.) ираствор превращается в шламм добавлением 225 г силикагеля. Шлаки загружается в верхнюю часть слоя сили-кагеля колонны с размерами 14 35 см,заполненной тай же смесью растворителей. Проявление осуществляетсясмесью этилацетат-метпленхлорид(40/60 об./об,), Головной прогон,составляющий 3 л, сбрасывается, азатем собираются Фракции объемам800 мл каждая,Хроматография при обращенно-фазовом заполнении.40 мл из 12 Фракциии хроматаграфической процедуры концентрируетсяда масла весом 500 мг и затем масловновь растворяется в 5 мл ацетонитрига. Этот ацетонитрильный растворзагружается в хроматографическую ко. -лонну из нержавеющей стали с размерами; внешний диаметр 1,59 см, длина 1,8 и, заполненную препаративнойобращенной фазовай жидкостью для колонн хроматографии Бондапак С 18/Поразил В. Колонна элюируется смесью,содержащей 55% об,/аб. ацетанитрилаи 45% и 0,05 М раствора Фосфатааммония, рН 3, Объем элюированиямежду 1360 и 1700 мл собирается наоснове исследования показателя преломления. Органический растворительудаляется пад вакуумам и остаточныйводный раствор экстрагируется этилацетатам. После удаления под ваку"умом этилацетата остается 120 мгсоединения, которое кристаллизуетсяиз концентрированного ацетонитрило"ваго раствора, в результате чегообразуются кристаллы МЗП 883 (соединение 11), т.пл, 129-131 С, молекулярный вес 406, найдено при помощи спектроскопии 406, 2706, рассчитано 406, 2719.Оптическое вращение.твующие оксикис тогда имеет ст СОО си нП р и м е р 4Ингибирование впробирке редуктазы НМС кофермента ЛИспользуется модифицированный О метод Бега. Модификация заключаетсяв инкубировании Фермента с ингибитором в течение 5 мин перед инициирванием реакции с субстратом. Приработе с такими сильными ингибитор 5 ми, какими являются новые соединения, стандартная процедура, в соответствии с которой фермент дабавля.ется только в смесь ингибитор-суб"страт, дает нелинейную кинетику.50 Используя модифицированную процедуру, соль натрия соединения 1 Чдает показатель 1 С ингибирредуктазы НМС-СаА, равный 2,по сравнению с 5,4 10 М дл д 55 нения М 1. 236 В. а 253432ре 5,23 мг/мл СН, С 11. Это значениеполучено при помощи измерения длиныволны линии натрий-П.зС ЯМР химические сдвига 5 (СОС 1 з ) р ррм11,8; 14,9," 16,5, 21,1; 23,1;35,9, 37,4; 48,5; 38,6; 41,9 (2 С);62,3; 70,1; 76,5; 131,0; 132,6, О 171,2 и 176,7.На основании этих и других данныхможно предположить, что продукт имеет следующую химическую стереоструктуруХарактернос)= 148,оптическое вращениеопределяют на раство Ингибиравание в реальных условияхсинтеза холестерина (соединение 11).Составитель В. РомановаТехред В. Кадар Корректор М. Поко Редактор Н. Бобкова Тираж 490 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Заказ 4635/60 Производственно-полиграФическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная,4 15 1Нескольким группам самцов крыс Голтцмана вводится либо 5 Ж эмульфор в соляном растворе, либо испытываемое соединение в эмульфоре через трубку, введенную в желудок. Спустя 1 ч вводится ВП 80 ИСдС ацетата/ /кг, Затем спустя 50 мин производится анализ крови крыс и определяетсяисодержания С холестерина, как ме" ры синтеза холестерина;Доза, мг/кг Ингибирование,Х0,15 380,6 511:2 70П р и м е р 5, Сравнение соединений 1, 11 и %.-236 В, как ингибиторов синтеза холестерина в клеточной культуре.Используется модифицированная процедура А. У. Албертса и др. для измерения количества биосинтезированного С холестерина из мС уксусной кислоты в клетках мьппей 25343216Ь-М в культуре. Испытуемое соединение в 10 мкл диметилсульфоксида добавляется в монослойные культуры с5 фС ацетата. После 3 ч инкубиро 45 вания клетки омыляются и С холестерин экстрагируется и выделяется при помощи тонкослойной хроматографии на снликагеле с исполъзова"нием смеси петролейный эфир - диэтиловый простой эфир-уксуснаякислота (75:25:1), Область на алас 4тинке, содержащая С холестерин,устанавливается с использованием еетавляющего пятна на этой области 1,15 и содержаний С определяется при14помощи жидкостного сцинтилляционного счетчика,При помощи этой модифицированнойпроцедуры устанавливается, что сое 20 динение 11 дает значение 1 С дляингибирования редуктазы НМО-СоА,равное 17 нм, по сравнению с 22 нмдля соединения Е и 46 нм для соединения МЬВ.