Способ получения антибиотика казугамицина

п 1 454749 ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ Союз Советских Социалистических Республик1) Зависимый от патента 2) Заявлено 31.12.64 (21) 936224/30-15(33)Опубликовано 25,12.74, Бюллетень47 Государственныи комитет Совета Министров СССР ло лелам изобретенийи открытий К 615,779. .931: 63(088,8) та опубликования описания 28,02.75(72) Авторы изобретени ИностранцыТомио Текучи, Иосиро О(Япония)Иностранная фирмаоджин Бисеибуцу Кага(Япония) ками и М Хамада мао Умеза 1) Заявител Кенк 3 и(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА КАЗУГАМИЦИНА Изобретение относится к способам получения физиологически активных веществ с помощью микробиологического синтеза, точнее к способу получения антибиотика казугамицина.Казугамицин подавляет рост и предупреж дает развитие Р 1 псц 1 апа опкае, не оказывая вредного влияния на растения. Он образует кристаллические соли с бромистоводородной, серной, соляной и другими кислотами.Хлоргидрат казугамицина представляет со бой бесцветное кристаллическое вещество, растворимое в воде, почти не растворимое в метаноле, этаноле, бутаноле, ацетоне, эфире, хлороформе и бензоле, в Уф-спектре которого отсутствуют полосы поглощения при 220 - 1 400 ммк, Это вещество дает положительную реакцию на нингидрим в пиридине и отрицательную реакцию Сакагучи, Молиша, ЭлтсонМоргана, фелинга, Толленса и Селиванова.2Для хлоргидрата (а =+120 (с=1,6% вода); т. пл, 202 - 204 С (с разл.), рК,1; мол. вес 453 по данным титрования и 449 по данным осмометрии.СтвН 270 тоМз НС 1 НзО. 2Вычислено, %: С 38,44; Н 6,52; 1 ч 9,06; О 37,94; С 17,64.Найдено, %: С 38,58; 38,34; Н 6,94 и 6,62;1 ч 9,66 и 9,04; О 37,05 и 37,54; С 8,16 и 8,39.С 1 вНзтОтоХзНВг Н 20. з Вычислено, %: 7; О 34,62; Вг 15,72,Найдено, %: С 35,27; Н 6,00; М 8,48; О 33,31; Вг 16,94.ИК-спектор (таблетки КВг) хлоргидрата казугамицина, см . 3520, 3350, 3200, 3070, 2950, 2050, 1695, 1670, 1624, 1522, 1462, 1379, 1323, 1286, 1224, 1180, 1135, 1120, 1090, 1080, 1060, 1042, 1025, 975, 945, 908, 890, 870, 846, 825, 783, 709.ЯМР-спектор (РО, натриевая соль 3-(триметилсилил)-пропансульфоновой кислоты в качестве стандарта, прибор Вариан 60), м. д.: 1,22; 1,32, 2,25; 2,33; 2,42; 2,50; 3,55; 3,79; 4,05;4,38; 4,50; 4,70,5; 32,5; 5,35. Реакция с антроном после обработки азотистой кислотой дает красновато-бурую окраску. При высоком вольтаже электрофореза в системе муравьиная кислота - уксусная кислота - вода (25: 75: : 900), рН 1,8, 3000 в/40 см, 15 - 20 ма/10 см и 10 С в течение 15 мин казугамицин перемещается на 3,7 см к аноду. К 1 на фильтровальной бумаге Тойо159 в системе бутанол-уксусная кислота - вода (2: 1: 1) равно 0,28, в системе бутанол в этанол в водав (4: : 1; 4,9: 0,1) равно 0,07, а в системе бутанол - уксусная кислота - вода (6,3: 1: 2,7) равно 006 Кислотный гидролиз . казугамицина дае,50 55 60 65 остаток, а баритовьш гидролиз приводит кобразованию С 4 НоОюИ 2 Н,О, который, гидролизуясь дальше, образует СНО 7 М и щавелевую кислоту,При нагревании водного раствора казугамицина при б 0 С в течение 1 час при рН 2,0;5,0; 7,0 и 9,0 сохраняется 82,5; 99,0; 9,0 и100% активности соответственно. После хранения в течение 6 час при комнатной температуре в 0,1 н. соляной кислоте никаких явленийразложения не наблюдается; после храненияв 0,1 н. едком натре в течение б час сохраняется 85/о активности, Казугамацин достаточностоек при перегонке в вакууме, распылительной сушке или других способах, применяемыхдля концентрирования или сушки культуральных жидкостей илп водных растворов, содержащих казугамицин,Известен способ получения казугамицина,включающий культивирование гриба из группы Ягер 1 оптусез на питательнои среде, содержащей источники углерода и азота, в аэробных условиях глубинным методом в течениевремени, достаточного для перехода в культуральную среду основной части целевого продукта с последующим выделением его из культуральной жидкости,Предлагается в качестве гриба-продуцентраиспользовать Ыгер 1 огпусеэ 1 аьцдаепз 1 з, культура которого, выделенная из почвы и имеющая лабораторное обозначение Мо 338-М 1, хранится в американской коллекции типовыхкультур в Вашингтоне под номером АТССМо 15714 и АТСС Мо 15715.Характеристика 5. ИазираепькМикроскопическая характер и ст и к а. Субстратный мицелий дает тонкие отростки и образует длинные воздушные гифы,кончики которых имеют вид петель или спиралей, с образованием цепочек. Мутовки на наблюдаются. Под электронным микроскопомповерхность спор гладкая, без шипов или волосков.В чашках с агаро-глицериновой средой Чапека (глицерин-нитратный агар) после инкубации при 27 С колонии от кремового до серо-оливкового или желтовато-коричневогоцвета. Скудный белый воздушный мицелий,Бледно-оливковый или бледный желтоватокоричневый пигмент в среде.В чашках с глюкозо-аспарагиповым агаромКраинского после инкубации при 27 С колонии от кремового до светло-коричневатого цвета или с красновато-бурым оттенком, Воздушный мицелий от белого до светло-оливковогоили серо-оливкового цвета. Темно-желтоватыйили темно-желтовато-коричневый пигмент всреде.На агаровой пластинке с яблочнокислымкальцием после инкубации при 27 С колониицвета слоновой кости. Воздушный мицелий отбелого до песочного цвета, Растворимого пигмента нет. Яблочнокислый кальций вокруг колонии обычно растворяется и становится про 5 10 15 20 25 30 35 40 45 зрачным, но в случае слабого роста это явле.ние не наблюдается.В чашке с крахмальным агаром после инкубации при 27 С колонии цвета слоновой кости, Бслый воздушный мицелнй. Растворимого пигмента нет. Гидролитическое действие слабое или отсутствует.В пептоповом растворе, содержащем 0,2/ооу нитрата натрия, после инкубации при 37 С бесцветные колонии на поверхности. Отсутствие воздушного мицелия. Растворимый пигмент отсутствует. Нитрат восстанавливает.На скошенном агаре после инкубации при 37 С колонии от кремового до бледно-желтовато-коричневого или красновато-бурого цвета. Незначительное образование воздушного мицелия. Растворимый пигмент отсутствует.На молочном обрате после инкубации при 37 С бесцветные колонии без воздушного мицелия. Коагуляция или пептонизация наблюдаются лишь изредка и в слабой степени, Растворимый пигмент отсутствует.На желатине после инкубации при 18 - 20 С бесцветные колонии, иногда приобретающие красновато-бурую окраску. Бледно-коричневатый растворимый пигмент. Иногда наблюдается разжижение желатины.Потребление источников углерода при выращивании в основной среде Придгем-Готлиба после инкубации при 27 С; усваивает глюкозу, фруктозу, галактозу, маннозу, инозит, мальтозу и рафинозу, давая обильный рост. Плохо усваивает рамнозу, сорбит, салицин, дульцит, сахарозу и инулин. Незначительно усваивает арабинозу, лактозу, декстрин и крахмал.Образование антибиотика казугамицина. Штамм Мо М 338-М относится к роду стрептомицетов, с длинным воздушным мицелием, кончики которого имеют вид петель или спиралей. Поверхность спор гладкая, Протеолитическая активность слабая. Цвет воздушного мицелия от белого до серо-оливкового, а цвет колоний от кремового до бледно-желтовато- коричневого или красновато-бурого. Нехромогенного типа. Образует казугамицин. Штамм Мо М 338-М 1 близок к Б. Мювэппцз и 8. да 1 Ьцз. Однако 5. да 1 Ьцз имеет волосистую структуру (на поверхности спор), а 8. Ы 1 изз 1 гпцз вырабатывает золотисто-желтый растворимый пигмент и проявляет сильное протеолитическое действие. Выделенный из почвы штамм Мо М 338-М 1 образует также другие антибиотики - ауреотрицин и тиолютин. Поэтому штамм Мо М 338-М 1 следует сравнить с 8, 11 поц 1 ез, 8, се 11 ц 1 о 11 ацз и 5. суапоПаццз.5. 11 п 1 о 1 ц 1 ецз образует завитки, Я. се 11 ц 1 ойацз образует желтовато-зеленый пигмент и проявляет сильное протеолитическое действие Ь, суапо 11 ацз не образует спиралей, дает зеленовато-синий пигмент и проявляет сильное протеолитическое действие. По этим признакам штамм М 338-М 1 отличается от указанных видов. Кроме того, штамм М 338-М 1 от 45474945 50 55 60 65 личается от этих видов своей чувствительностью к различным антибиотикам,Мутанты штаммаМ 338-С с более интенсивной желтоватоц окраской были получены в результате одцоспорового рассева штамма М 338-М 1, а мутанты с красноватым или красновато-пурпурным цветом были получены при выделении отдельных колоний после УФ-облучения. Мутанты, не образующие ауреотрицин и тиолютин, но образующие казугамицин, получены из штамма338-М 1, который первоначально вырабатывал аурсотрицин и тиолютин.Я, )аэцдаепз 1 з вырабатывает казугамицин при выращивании в соответствующих условиях, Культуральную жидкость, содержащую казугамицин, получают путем посева спор или мицелия микроорганизма в соответствующую среду и выращивания в аэробных условиях. Ферментацию обычно проводят при 25 - 35 С.В качестве источника азота используют пептон, мясной экстракт, кукурузный экстракт, размолотый хлопковый жмых, размолотый арахис, соевую муку, дрожжевой экстракт, 1 х 1 - У-амин, казеин, нитрат натрия, нитрат аммония, сульфат аммония и другие азотсодержащие соединения, например пшеничную или рисовую муку.В качестве источника углерода пригодны лактозы, глицериц, сахароза, крахмал, глюкоза, мальтоза, меласса и другие углеводы в чистом или неочищенном виде. Предпочтительны чистые или неочищенные мальтозы и крахмал, гидролизованцый до мальтозы. Можно также добавить хлористый натрий, фосфат натрия или калия, карбоцат кальция или сульфат магния, соли металлов.Фермснтацию продолжают до накопления достаточного количества казугамицица в культуральной жидкости. Например, споры или мццелий культуры Я. 1(авцдаепз 1 з на скошенном агаре выссвают в среду, содержащую 2% глюкозы, 1,5% соевой муки, 0,1% К,НРО, 0,05% Мд 504 7 НО и 0,3% хлористого натрия, доводят рН до 7,0, выдерживают в колбах на качалке в аэробных условиях при 27 С. Накопление казугамицина отмечают на третий - пятьш дци. В этом случае одновременно продуцируются аурестрицин, тиолютин и полиеновые антибиотики. Казугамицин с трудом извлекается из культуральной жидкости, например бутанолом, оутилацетатом и этилацетатом, в то время как ауреотрицин или тиолютин и полиеновые антибиотики хорошо извлекаются особенно бутанолом.П р и м е р 1. Для определения ацтибиологической активности казугамицина 100 г измельченной зеленой листвы или рисовой соломы заливают 1 л воды, кипятят 30 миц, фильтруют через четыре слоя марли, доливают воду к фильтрату, доводя объем жидкости до 1 л. К полученному раствору добавляют саха- розу и агар (конечная концентрация 5,0 и 2,2% соответственно). Затем 20 мин стерилцзуют в автоклаве при 120 С, смешивают со 5 10 15 20 30 35 40 стерилизованным буфером (рН 3,5), состоящим из 1/15 М двухзамещенного фосфорнокислого натрия и 1/15 М соляной кислоты (или 0,1 М лимонной кислоты и 0,2 М фосфата натрия, взятых в отношении 24,3: 25,7, чтобы довести рН до 5,0) в отношении 1: 1, 10 мл полученной смеси выливают в чашку Петри диаметром 10 см и дают застыть. 4 мл суспензии спор Р. огугае в указанной среде выливают на поверхность застывшей среды. Поверх засеянноц агаровой среды ставят цилиндры и наполняют образцом или стандартным раствором, рН которого должен быть равен рН среды. Чашку Петри инкубируют 48 час при 27 С. Измеряют диаметр зоны задержки роста вокруг каждого цилиндра, Хлоргидрат казугамицина в дозе 30 мгк/мл дает зону задержки роста диаметром 30 мм. Если в растворе образца содержатся ауреотриццн, тиолютин или полиеновые антибиотики, то определение проводят после их извлечения бутацолом при рН 2,0.П р и м е р 2. Для приготовления культуры в колбы на 500 мл помещают 125 мл среды и при 27 - 29 С на качалки (амплитуда 8 см, 200 качаний/мин) .При выращивании в фермецтерах из нержавеющей стали емкостью 30 л в 15 л среды подают 20 л/мин воздуха и перемегццвают со скоростью 600 об/мин.Прц работе с фермсптерамц емкостью 400 л в них загружают 180 - 200 л среды и подают 200 л/мин воздуха при псремецшванци со скоростью 200 об/мип.При посеве в колбах на качалках и фсрмсцтерах со скошенного агара со штаммомМ 338-М 1 высевают петли в спеду (рН 7), содержащую 1,5 о/о глюкозы, 1.5 ооо соевой м- ки, 0.1% К.НРО, 0,05% МАМБО 7 НО, 0,3% ХаС 1 и О 5% СаСОо. встряхивают в колбах в течение трех дней прп 27 - 29 С. Полученную культуральную жидкость используют для посева. П р и м е р 3. В колбах ца качалках цри использовании основной среды (рН 7), содержащей 1,5% соевой муки 0,о/о К.НРО, 0,05% МАМБО 7 Н,О и 0,3% КаС 1, ц различные источники углерода, получают дапцые, приведенные в табл. 1.П р и м е р 4. При основной среде, содержащей различныс источники азота, 1,5% мальтозы, 0,3 ХаС 1, 0,1% КНРО.ь 0,1% МАМБО 7 Н,О 0 0007% Сп ЯО . 5 Н,О 0 0001 о/о РеЯО. 7 Н.О 0 0008 о/о МпС 1, 4 НоО и 0,0002% ХпЯО, 7 Н",О. рН 7,0, получены результаты, приведенные в табл. 2.Казугамициц может быть выделен из водных растворов адсорбцией ца активироваццом угле или катиоцообмсццоц смоле, содержащей в качестве активной группы сульфоновую кислоту. Элюирование производят кислым водным раствором или лучше водным раствором аммиака. При использовании сульфосмолы элюированию способствует увеличение конЧисло "днейфермен- тапии рН Источник азота Источник углерода рН редуциру юлих сахаров казугамицина 0,75% пептана, 0,3% мясного экстракта+0,5% глюкозы 1,5% соевой муки ОД РН 4)2 ЯО 44 час 18 час начало 0,51,02,04,0 100 95 76 55 45,0 25,0 12,5 5,0 15 центрации соляной нлн серной кислоты выше 0,5 н.Стойкость казугамицина в водном растворе аммиака при 37 С представлена в табл. 3.Таким образом, элюирование аммиака проводят при возможно более низких температуре и концентрации. Желательно также быстрее доводить рН элюата до нейтрального, после чего упаривать его в вакууме.Казугамицин по своему строению относится к сахарам и поэтому может адсорбироваться анионообменной смолой, обработанной борной кислотой, и может быть элюирован соляной кислотой. Анионообменные смолы в ОН-форме пригодны для нейтрализации кислых растворов казугамицина (рК казугамицина равен 6,6 - 7,1) и, следовательно, казугамицин является слабым основанием. Адсорбция казугамицина катионообменной смолой задерживается или снижается при наличии примесей, имеющих свойства сильного основания, Поэтот катионообмспные смолы полезпы также 45 50 55 60 65 для удаления в случае необходимости примесей, являющихся сильными основаниями. Материал, содержащий казугамицин и примеси с сильными основными свойствами, пропускают через колонну, содержащую соответствующее количество 1 КС, Иа или Н-типа, для удаления сильных оснований, а затем казугамицин адсорбируют смолой 1 КС, с которой его элюир уют. Для удаления массы мицелия из культу- ральной жидкости могут быть использованы фугованне, фильтрация и другие обычные Сп 0 454749 10собы; Отделение мицелия происходит легче при подкислении культуральной жидкости и добавлении активированного угля. Культуральная жидкость поступает на ионообменную колонну после удаления твердых частиц, включая мицелий, или сначала поступает на фильтрацию через решетчатый фильтр, достаточно мелкий, чтобы поддерживать частицы смолы, после чего фильтрат, содержащий мелкий мицелий, может поступать на ионообменную колонку.рН культуральной жидкости доводят до 2,0 и добавляют 0,5% активированного угля от конечной концентрации. После достаточного перемешивания и фильтрации рН фильтрата доводят до 5,5 - 6,5 и направляют в колонну, загруженную смолой 1 КСв Н-форме, неспособной адсорбировать казугамицин. рН прошедшего раствора доводят до 4,0 и подают на колонку, содержащую 1 Кв Н-форме или лучше аммиачного типа, чем к 1 а - типа (для адсорбирования казугамицина).Затем элюируют водным раствором аммиака и элюат нейтрализуют. В этом случае желательно проводить элюирование при температуре ниже 15 С и нейтрализовать элюат в крайнем случае не позже 5 час после элюирования.Элюат выпаривают досуха или сушат вымораживанием до получения порошка - сырца казугамицина.По другому способу в культуральную жидкость добавляют активироганный уголь. Лдсорбированный казугамицин элюируют воднометанольным раствором, подкисленным соляной кислотой, и элюат концентрируют и сушат. Полученный таким образом порошок-сырец может подвергаться дальнешдей очистке смолой 1 Кописанным выше способом. По третьему способу поропок-сырец растворяют в воде и пропускают через колонку с активированным углем. После промывки элюируют соляной кислотой, например 0,05 н, а активные фракции нейтрализуют аниопообменной смолой. После концентрации в вакууме добавляют 10 - 25 объемов этанола, выдерживают при низкой температуре и получают кристаллы хлоргидрата казугамицина.Описанные способы являются предпочтительными при экстрагировапии и очистке казугамицина, Так же как и при получении других антибиотиков, кристаллы могут быть получены и без хроматографии на активированном угле, если концентрация казугамицина в культуральной жидкости достаточно высока. Например, вакуум-выпарка активного элюата, полученного с 1 К, дает кристаллы хлоргидрата казугамицина при содержании в культуральной жидкости казугамицина в концентрации свыше 500 мкг/мл. При использовании серной кислоты 1 вместо соляной) можно получить сульфат казугамицина.Ввиду слабых основных свойств казугамицина он может быть получен осаждением из водных растворов добавлением кислых и водонерастворимых веществ, таких как пентахлорфенол. лаурилсульфоновая кислота, тергитол.Казугамицин проявляет сильное защитноедействие против пирикуляриоза риса без фито- токсичности. Хотя он и не подавляет рост Р. огукае в концентрации 100 мкг/мл в среде ЯаЬапгапс 1, он подавляет рост этого гриба при 0,1 - 1,0 мкг/мл в подкисленном рисовом соке,Он эффективен также в опытах в тепличныхусловиях.Листья риса заражают суспензией Р. огухаев стерилизованной воде, выдерживают 20 - 24 час во влажноп теплице и затем - в обычной теплице семь днеи, и подсчитывают число пятен на 10 листах из трех всгетационных сосудов. В одном опыте опрыскивание казугамицином в концентрации 5 мкг/мл уменыцило количество пятен на 1 О листах до восьми прп 20 мкг/мл - до 0,3, при 40 мкг/мл - до нуля, 20 в то время как контрольные листья без нанесения казугамицина дали 176 или даже больше пятен. Защитный эффект казугамицина превышает защитное действие блястицидиня 5. Казугамицин в концентрации 100 мкг/мл и.вызывает фитотоксических явлений у рисовых растений.Для защиты риса от пирикуляриозя нетнеобходимости в тщательной очистке казугамицина. Можно использовать саму культуральную жидкость продуцента казугамицина или высушить ее для получения порошка.Несмотря на то, что бластицидин 5 известенкак эффективный антибиотик против пирикуляриоза риса, его можно легко отличить от казугамицина по физико-химическим свойстгам, антимикробному действиютоксичности.Бластипидин Я, оказывает сильное токсическое действие на животных и людей и фито- токсическое децствие в концентрации, превы шающей 20 мгк/мл. Хотя казгамицин относится к аминосахарам, по физико-химическим свойствам, он отличается от трегалозамина своей формулой, аптимикробным действием, хроматографией на бумаге, ц также легко от личается от гигромицина В и В. оптическимвращением, антпмпкробным действием и прочими свойствами. Казугямицин обнаруживает специальный антимикробный спектр в специальных условиях и среди известных антибиотиков нет подобного соединения.П р и м е р 5. Среду, содержащую 1.5% глюкозы. 1.20 о соевой муки. О, % К.НРО 0,05% МАМБО 7 Н,О, 0,3% ХаС 1, 0,5% СаСО и 40 мл силиконовоп смолы, загружают в 400-л Аерментер из нержавеющеп стали. После стерилизации рН доводят до 6,6. Для гашения пены сбоку ферментера устанавливают резервуар на 900 мл соевого масла, и после 30 час инкубирования приливают дополнительно 500 мл60соевого масла. Условия дерментяции следующие: пеоемешивание 200 об/мин, воздух - 180 л/мин, темпсратупа инкубацип 27 С, рН после 24 час шанд бирования и через каждые 6 час вплоть до 90 час от начала инкубациисоответственно: 6,2; 5 А; 5,1; 5,2; 5,3; 3,8; 5,8;5,9; 6,0; 5,7; 6,6 и 6,6. Через 92 час ферментации берут культуральную жидкость. Казугамицин, находящийся в культуральной жидкости, лает зону подавления роста диаметром 30 мм. Раствор, разбавленный в 128 раз, эсЬ- фективен при борьбе с пирикуляриозом риса в вегетационных сосудах. Эту культмпальную жилкость полают на центрифугу Шарплесс для отлеления мипелия, при этом получают 310 л Фильтрата. рН фильтрата доводят до 7,0 и добавляют 12,5 кг активированного угля. После перемешивания фильтруют от угля через фильтрующую ткань и фильтповальную бумагу, Фильтпат обладает линь 5 - 10% активности культурального сЬильтоата. К пипогу, полученному после Фильтрации, лобавляют 37,5 л растворителя, состоящего из бутанола и волы С 1: 2) и элюипуют ппи 45 С, доводя рН ло 2,0 соляной кислотой. Элюиоование повторяют три раза и элюаты собиоаот вместе. Элюату (112,5 л) лают отстояться, а водный слой в 90 л концентрируют Супаривают) в вакууме до объема 3,58 л. Концентрированный раствор сушат вымораживанием и получают 1,23 г казугамицина в виде бурого попошка (степень чистоты 1,8%).Прим е р 6. Среду объемом в 180 л того все состава, что и в примере 5, загружают в ферментер на 4000 мл и добавляют 18 мл силиконовой смолы. После доведения рН до 7,0 1 н. едким натром пповодят стерилизацию при 120 С в течение 20 мин. Среду асептически засевают 1500 мл трехдневной культуральной жидкости (полученной в колбах на качалке) штаммаМ 338-М 1. Сбоку ферментера устанавливают резервуар с 900 мл соевого масла для пеногашения. Кроме того, через 21 час после начала ферментации добавляют 200 мл соевого масла и 300 мл через 22 час. Перемешивание - 200 об/мин, аэрация - 150 л/мин в течение всего процесса ферментации, температурный режим в интервале 27 - 28 С. рН, общее содержание сахаров и количество казугамицина определяют через 12, 24 час и затем через каждые 6 час ло истечения 92 час с начала ферментации. При этой ферментации одновременно образуется ауреотрицин (или тиолютин). Результаты приведены в табл. 4.Полученную культуральную жидкость, содержащую 518 мкг/мл или 82,944 г казугамицина, подкисляют 1 н. соляной кислотой ло рН 2,0, и загружают активированный уголь в количестве 0,5%. Полученную смесь подают на центрифугу Шарплесс с числом оборотов 15000 об/мин и получают 160 л фильтрата (460 мкг) мл, всего 73,728 г казугамицина.Фильтрат подщелачивают 1 н. едким натром, доводя рН до 7,0, и добавляют 3,2 кг активированного угля (2,0%) для адсорбирования казугамицина. Затем опять фугуют на той же центрифуге, собирают угольный пирог, Жилкая часть содержит казугамицин в концентрации 17,12 мгг,.лл и сохраняет 29,1 % активности исходн .й культуральной жидкости, Угольный пирог обрабатывают 22,5 л25236432 ) 15 6,2 6,2 - 6,4 14 11 18 24 6,4 396 504 450 518 6,2 - 6,4 6,4 6,8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 0 65 90%-ного метанола и 1 н. соляной кислотой, доводя рН до 2,0. Элюирование проводят при 40 С. Затем проводят второе элюирование 80%-ным метанолом и получают 45,21 л элюата. Элюат содержит казугамицин в концентрации 851,8 мкг/мл (всего 38,501 г); выход ог первоначальной культуральной жидкости ра-. вен 46,41%. рН элюата доводят до 4,0 - 5,0, метанол отгоняют в вакууме. Полученный таким образом водный раствор сушат вымораживанием и получают бледно-желтоватый порошок с активностью 54 мкг/мг (по расчету 36,504 г казугамицина). Выход порошка составляет 44% в пересчете на первоначальный раствор, а чистота равна 5,4%.П р и м е р 7, 150 г порошка-сырца (1,8% чистоты), полученного как в примере 5, растворяют в 2 л дистиллированной воды и подают на колонку высотой 100 см, диаметром 5 см, заполненную углем для хроматографирования. Скорость потока 3 мл/мин при комнатной температуре. Протекающая жидкость не обнаруживает присутствие казугамицина. Колонку с углем промывают 4 л дистиллированной воды и 0,05 н. соляной кислоты, Первая фракция 1600 мл при рН 5,6 не содержит казугамицина. Следующая фракция в 3000 мл имеет рН 1,0, и последующая фракция 200 мл также имеет рН 1,0. Обе они содержат казугамицин. Эти активные фракции нейтрализуют ионообменной смолой (помех - 3) и концентрируют в вакууме до объема 10 мл. К полученной массе добавляют 200 мл этанола и оставляют на ночь при 4 С, выпадает желтовато-белый осадок. После фильтрации и сушки осадка получают 10,84 г белого порошка. Выход составляет 97,8%.П р и м е р 8. 1,15 г порошка, полученного как в примере 7, (с 36% чистоты) растворяют50 55 60 65 в 150 мл дистиллированной воды и доводят рН до 7,0, Раствор подают на колонку с углем, длиной 29 см, диаметром 3 см. Процесс ведут при комнатной температуре, скорость потока 1 мл/мин. Колонку промывают 350 мл дистиллированной воды. Затем пропускают 0,02 н. соляную кислоту и элюат фракционируют по 10 мл. Начальная фракция (520 мл) с рН 5,6 не содержит казугамицина. Ближайшие две фракции 20 мл (рн 4,0) не содержат казугамицина. Следующая фракция 10 мл (рН 2,0) содержит казугамицин, но при хроматографировании на бумаге обнаруживает присутствие некоторых веществ, дающих положительную реакцию на нингидрин. Следующие 130 мл, рН ниже 1,0, содержат казугамицин, но содержат также и другие вещества, дающие положительную реакцию на нингидрин. Следующие 430 мл, рН ниже 1,0, содержат казугамицин без примеси веществ, дающих положительную реакцию на нингидрин. Эту фракцию нейтрализуют смолой Вотчех - 3 и концентрируют в вакууме до 5 мл, К концентрату приливают 100 мл этанола и получают белый порошок весом 301 мг, 92% чистоты. Выход 66,8%. Порошок перекристаллизовывают из воды и получают 120 мг хлоргидрата казугамицина в виде кристаллов.П р и м е р 9. Среду, содержащую 1,5% мальтозы, 1,5% соевой муки, 0,1% К,НР 04, 0,05% Мд 304 7 Н,О, 0,3% ИаС 1 (рН 7,0), засевают штаммомМ 338-М 1 и взбалтывают в колбах на качалке. 3450 мл культуральной жидкости, содержащей казугамицин, подкисляют 1 н. соляной кислотой, доведя рН до 2,0, добавляют 1% Нуйезцрегсе 11 е и 0,5% активированного угля и фильтруют, При этом казугамицин практически не адсорбируется. рН фильтрата доводят до 7,4 и добавляют 2% активированного угля для адсорбирования казугамицина. Собирают угольный пирог, адсорбировавший казугамицин. В этом случае фильтрат содержат еще примерно 10 - 23,5% казугамицина. Затем угольный пирог обрабатывают 690 мл 80%-ного метанола, подкисляют 2 н. соляной кислотой, доведя рН до 2,0, и проводят элюирование при 45 С. Добавляют 350 мл 80%-ного метанола и повторяют элюирование. Собирают вместе оба элюата. Содержание казугамицина в элюате 62%. Подщелачивают метанольный элюат 1 н. едким натром, доведя рН до 4,0, и упаривают в вакууме до сиропообразного состояния. К концентрату приливают этанол до прекращения выпадания осадка. Этот осадок содержит казугамицин, а верхний слой жидкости содержит лишь 5 - 10% казугамицина. Собирают осадок и получают желтовато-белый порошок казугамицина 5,3% чистоты. Выход равен 45% в расчете на исходную культуральную жидкость.П р и м е р 10. 5 г порошка, полученного как в примере 5 (1,8% чистоты), растворяют в 500 мл воды, доводят рН до 4,0, Раствор подают на колонку, заполненную 100 см смолы 1 Кв Н-форме, скорость потока 1 мл/мин. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 После промывки колонки 1 л дистиллированной воды пропускают 0,5 и. раствора аммиака со скоростью 1 мл/мин. 100 мл раствора нейтрализуют 1 н. соляной кислотой, сушат вымораживанием и получают 1,6 г желтоватого порошка 9%-ной чистоты. Выход 88,9%.П р и м е р 11. Мутант, полученный из п,тамма М 338-М 1 путем односпорового рассева, выращивают в колбах на качалке в среде с таким же составом, как в примере 5, в течение 72 час. 1 л культуральной жидкости засевают 100 мл среды, содержащей 1,5% соевой муки.1,5% мальтозы, 0,3% МаС 10,1% Мд 804 7 Н.О, 0,000/% Сц 504 5 Н,О, 0,0008% МИС 1, 4 Н,О, 0,0001% Ге 504 7 Н,О, 0,0002% Хп 504 7 Н 0, рН 7,4, в 200-л ферментере, аэрация 100 л/мин воздуха, перемешивание - 200 об/мин. Ири 28 С.Через 48 час этои культурой засевают 1400 л такой же среды в 2000-литровом ферментере и продолжают ферментацию. Через 48 час рН 6,9, а концентрация казугамицина 160 мкг/мл; черсз 90 час рН 7,2, а концентрация казугамицина 530 мкг,мл. Кльтуральная жидкость содержит 8,4 мкг/мл ауреотрицина. Ферментацию останавливают, а культуральную жидкость фильтруют через диатомнтовую землю. Получают 1570 л фильтрата, включая промывные воды. Берут 100 л смолы 1 Кв Н - форме и раствор аммиака в таком количестве, чтобы перевести 1/4 смолы в смолу аммиачного типа, затем промывают водой. Культуральную жидкость пропускают через колонку, заполненную вышеописанной смолой,Первая фракция объемом 610 л не содержит казугамицина; следующая 950 л) содержит 65,2 г казугамицнна. Эту фракцию пропускают через другую колонку со смолой. Проводят элюирование первой смолы, используя 0,5 М раствор аммиака, Первый элюат (53 л) содержит 28,5 г казугамицина, второй элюат (200 л) - 738 г казугамицина, третий элюат (200 л) - 44,2 г казагумицина. Элюат нейтрализуют соляной кислотой, доведя рН до 6,6. Второй элюат концентрируют в вакууме до объема 6,32 л и добавляют 60 мл этанола. Получают 850 г неочищенных кристаллов хлоргидрата казугамицина, 90% -ной числоты. Предмет изооретения 1. Способ получения антибиотика казугамицина, включающий культивирование гриба из группы Ягерогпусез на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, в аэробных условиях глубинным методом в течсние времени, достаточного для перехода в культуральную среду основной части целевого продукта, с последующим выделением его из культуральной жидкости, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что в качестве гриба-продуцента берут Ягер 1 огпусез 1 азцдаепз 1 з АТСС15714 и АТСС15715,Составитель М, Дранишников Техред Т. Миронова Корректор Н. Стельмах Редактор Д. Пинчук Подписное Заказ 396/6 Изд.295 Тираж 456 ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр, Сапунова, 2 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что питательная среда содержит мальтозу.3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что казугамицин выделяют путем адсорбции на угле или катионообменной смоле с последующим элюированием,4, Способ по п. 3, отличающийся тем,что катионообменная смола содержит в качестве активной группы сульфоновую кислоту.5. Способ по п. 3, отличающийся тем, 5 что элюирование проводят раствором аммиака.