Способ получения ингибитора глюкозидаз

(61) Зависимый от патента 51) М.(33) ФРГОпубликовано 25.12,74. Бюллетень47 Гасударственным хвмитетСввета Мммистрвв СССРвв делам изобретенийи ОткрытиЙ 615.779.9(53) Дата опубликования описания 06.02.75(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА ГЛЮКОЗИДА Концентрации источнико О а также концентрации со широких пределах, прич Мя 504 мог 1 т полностью дают, например, 100 - 200 тельной среды в колбы 5 стью 1 л, стерилизуют из засевают исследуемым шт ют колбы на аппарате дл 15 - 60 С, предпочтительнов углерода и азотлей колеблютсяем ГеЗО 4, СаСО, иотсутствовать, Помл жидкой питаЭрленмейера емковестным способомаммом и инкубируя встряхивания припри 24 - 50 С. а, в Изобретение относится к производству лекарственных препаратов.Известен способ получения ингибиторов амилазы, заключающийся в том, что пшеничную муку грубого помола экстрагируют 10 - 90%-ными водными растворами низших спиртов или водными электролитами прп рН 1,0 - 7,0 и выделяют цслсвой продукт из стными приемами.Целью изобретения является повышение удельной активности и выхода целевого продукта.Для этого в качестве исходного сырья используют мицелий и/или культуральную жидкость актиномицетов.Из проб земли известным образом выделяют штаммы порядка Ас 11 потпусе 1 а 1 ез особенно семейств Ягер 1 огпусе 1 асеае и Ас 11 пор 1 апасеае или приобретают штаммы этого порядка из коллекций штаммов, Посевным материалом из этих штаммов засевают колбы для выращивания культур с жидкими питательными средами. Можно использовать, например, жидкую глицерино-гликокольную питательную среду, по фон Плото, состоящую из 2% глицерина, 0,25% гликоколла, 0,1% КаС 1, 0,1% КНРО 4, 0,01% Ре 504 7 Н.О, 0,01% МдЮ 4 7 Н,О и 0,01% СаСО,. Для ускерения роста целесообразно к подобной среде добавлять комплексныс источники углерода, например, воду от набухшей кукурузы или соевую муку, или дрожжевой экстракт, или белковые гидролизаты, например М 2 - амины, илп смеси этих веществ. В таких случаях необходимо регулировать значение рН жидкой питательной среды (начальное значение рН 6,0 - 8,0, предпочтительно) 6,5 - 7,5.Глицерин жидкой питательной среды можег быть заменен другими источниками углерода, такими как глюкоза пли сахароза, или крахмал, или смеси из этих веществ. Вместо гликоколла можно использовать и другие источники азота, например, дрожжевой экстракт, соевую муку МЕ-амины, Р 1 таппагпес 11 а и другие,20 25 Мицелии экстрагируют два раза ацетоном, каждый раз пятикратно (по отношению к объему мицелия), а потом один раз пятикратным объемом диэтилового эфира. Извлеченный мицелиевый остаток высушивают в вакууме при 20 С, полученный сухой порошок из мицелия извлекают 4 - 8 вес. ч. диметилсульфоксида (ДМСО) .Ингибиторы глюкозидаз являются пригодными терапевтическими средствами при следующих показаниях: ожирение, гиперлипсмия (атсросклероз), диабет, предиабет, гастрит, Ысцз .еп 1 псц 11, 1.1 сцв с 1 цодеп 1 и кариес, Токсичность ингибиторов глкнсозидаз чрезвычайно мала. П р и мер 1, Каждую из трсх колб Эрлен- мейера емкостью 1 л, которые содержат 200 мл жидкой питательной среды, состоящей из 2% крахмала, 1/, глюкозы, 0,5% АХ-аминов, 1/о дрожжевого экстракта, 04/, СаС 03 (стерилизация 30 мин при 121 С, перед стерилизацией рН 7,2) засевают 1 мл предварительной культуры штамма СВЬ 951.70, ЛЬрц 11 апе 1- 1 ае гедц 1 агЬ, полученной в той же жидкой питательной среде инокулированной культурами, выращенными в пробирках со скошенным агаром на основе овсяных хлопьев, и инкубируют при 28 С на вращающемся аппарате для встряхивания. После культивирования в течение 5,5 дней соединяют содержимое трех колб и отделяют мицелий центрифугированием. Получают 425 мл жидкости, содержащей 100 ЕИА/мл.Отделенную жидкость сгущают в ротационном испарителе при 15 - 20 торр и температуре водяной бани - 37 до 60 мл. Вязкий раствор смешивают с 480 мл этанола. Выпадающий осадок собирают центрифугированием, растворяют опять в 60 мл воды и подвергают диализу в течение 6 час с дистиллированной водой, диализат затем лиофилпзуют.Выход: 1,6 г с 19 10 ЕИА/г.П р имер 2. Из среды, описанной в примере 1, при центрифугировании получают 440 мл отделенной жидкости с 100 ЕИА/мл. Эту жидкость сгущают в ротационном испарителе до 100 мл. Сгущенньш раствор вмешивают в 800 мл этанола, осадок собирают центрифугированием и после двукратной промывки ацетоном и однократной промывки простым эфиром сушат при комнатной температуре в вакууме.Выход; 2,2 г с 15 10 ЕИА/г. Пример 3. Каждую из трех колб Эрлснмейера емкостью 1 л, содержащие по 200 мл жидкой питательной среды, состоящей из 3% глицерина, 3% осевой муки, 0,2% СаСО, (стерилизация 30 мин при 121 С, после стерилизации рН 7,2) засевают 1 мл предварительной культуры штамма СВЯ Ас 11 пор 1 апез зрес (полученной в той же жидкой питательной среде, инокулированной культурами, вырашенными в пробирках со скошенным пептонно -30 35 40 45 50 55 60 65 казенновым агаром Чапека) и подвергают трехдневной инкубации при 28 С на вращающемся аппарате для стряхивания,После инкубации соединяют содержимое колб и отделяют мпцелпй центрифугированием, Получают 500 мл отделенной жидкости, содержащей 450 ЕИА/мл.Отделенную жидкость смешивают при размсшивапии отдельными порциями с 250 г 1 чН-сульфата, а затем цептрифугируют в течение 1 О миц со скоростью 12000 об/мин.Осадок растворяют в 100 мл дистиллировышой воды и смешивают с 400 мл ацетона. Получается легко выпадающий осадок, его декантируют, два раза промывают ацетоном и один раз простым эфиром и сушат в вакууме.Выход: 13,4 г 10 10 з ЕИА/г. Пример 4. При засеве 120 мл жидкой питательной среды, описанной в примере 1, находящейся в колбе Эрленмейсра, емкостью в 1 л культурой штамма АТСС 3319 Ягер 1 огпусеь 11 асо 1 цз, выращенной в пробирке со скошенным агаром, после культивирования в течение 3 дней при 28 С на вращающемся аппарате для встряхивания получают культуральцый раствор, который содержит 25 ЕИА/мл. П р и м е р 5. Если засевают 24 колбы, содержащие по 120 мл жидкой питательной среды, описанной в примере 3, предварительной культурой штамма СВЯ 955.70 Ас 11 пор 1 апев зрес, и подвергают их в течение 5 дней инкубации при 28 С, то в результате центрифугирования получают 2,0 л отделенной жидкости 1,1 ЕИА/мл. Эту жидкость сгущают в ротационном испарителе до 200 мл и в течение суток подвергают диализу при комнатной температуре с 2 л дистиллированной воды в диализационном шланге Вискинга. Наружную среду, содержащую ингибитор, сгущают вращением до 100 мл и вкапывают при размешивании в 900 мл абсолютного этанола. Выпадающий почти неактивный осадок отделяют центрифугированисм и удаляют, а отделенную центрифугированием спиртовую жидкость сгугцают при вращении до 30 мл (1 мл этого концентрата содержит 70 ЕИА/мл,Для дальнейшей очистки этот раствор пропускают через анионообменную смолу (амберлит типа 11 сЛ 410, ацетатная форма в 0,05 М ацетате аммония, рН 7; размер слоя 2,5 20 см), соединяют активные фракции и подвергают гельфильтрации с помощью ЯерЙас(схн б 75 в воде. Активные фракции от гельфилы рации сгущают до 12 мл.1 мл этого раствора содержит 150 ЕИА/мл.500 мл мицслия извлекают два раза с помощью 1 л ацетона и один раз с помощью 1 л простого эфира, экстракты соединяют и сгущают при вращении в вакууме досуха, Получаемый мицелиевый остаток сушат в вакууме при 20 С, а получаемый сухой порошок мицелия ( -51 г) извлекают в течение 2 час454750 Предмет изобретения Составитель С. ЩеневаТехред Т. Миронова Редактор Д. Пинчук Корректор Н. Стельмах Заказ 154/18 Изд.215 Тираж 456 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб., 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 5при комнатной температуре с помощью 150 мл диметилсульфоксида. После центрифугирования в течение 30 мин при 15 000 об/мин) досуха сгущенный ацетоново-эфирный экстракт поглощается находящейся над порошком жидкостью диметилсульфоксида.Выход ингибитора: 120 мл с 3 ЕИА/мл. Способ получения ингибитора глюкозидаз,отличающийся тем, что, с целью повыше ния удельной активности и выхода целевогопродукта, в качестве исходного сырья используют мицелий и/или культуральную жидкость актиномицетов,