Способ получения l-лизина

298332 ОЙИСАНИ ЕИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ Сааа Советскик Социалистических РеспубликЗависимый от патентаЗаявлено 14.Ч 1.1968 ( 1266532 28-13) МПК С 124 13/О 7,55213/67. Япон 971. Бюллетень1 описания 12 Ч.1971 риоритет ЗО.Ч 111,19 публиковано 11,11 Комитет по деламобретений и открытийри Совете МинистровСССР УДК 663.15:668.39Дата опубликован второбрете Иностранец Казуми Араки(Япония) остранная фирма Хакко Когио Ко.,(Япония)аявите ПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Л-ЛИЗИНА Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения Е-лизина.Известен способ получения Е-лизина культивированием штамма СогупеЬас 1 епшп д 1 ц 1 аписцгп Мв аэробных условиях в водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и аминокислоты, в которых нуждается штамм для синтеза лизина, а именно гомосерин, или треонин+ + метионин, или треонин + цистин, или треонин + гомоцистин. Аминокислоты обычно вводятся в питательную среду в виде различных белковых гидролизолитов,Для повышения выхода 1.-лизина на стандартных средах предложено использовать мутанты, полученные из штаммов СогупеЬастег 1- цгп д 1 ц 1 атп 1 сцтп АТСС 14296 и МАТСС 13287 ультрафиолетовым облучением, например СогупеЬас 1 ег 1 цгп дц 1 аппсцтп М-2347 АТСС 21253, СогупеЬас 1 епцгп д 1 ц 1 апнсшп М-2279 АТСС 2154, СогупеЬас 1 ег 1 цгп д 1 ц 1 аппсшп М-2234 АТСС 21255, СогупеЬас 1 епцгп д 1 ц 1 апнсшп КУ 9494 АТСС 21299, СогупеЬас 1 епцтп д 1 ц 1 аппсцгп КУ 10092 АТСС 21300.Эти мутанты отличаются от родительского штамма повышенными питательными требованиями,2Мутант АТСС 21253 требует дополнительнолейцин, АТСС 21254 - гистидин, АТСС 21255 - изолейцин+ валин, по сравненкчо с мутантом АТСС 13287 АТСС 21299 требует 5 гистодин, АТСС 21300 лейцин по сравнени о соштаммом АТСС 14296.Ниже приведены сравнительные данные попитательным требованиям известных и предложенных штаммов.10 По предлагаемому способу пригодны каксинтетические, так и природные питательные среды, содержащие источники углерода, азота, минеральные соли и необходимые аминокислоты.15 В качестве источника углерода можно использовать углеводы (фруктозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу, крахмал, гидролизаты крахмала, глицерин, сорбит, органические кислоты (например уксусная и т. п.). Эти веще ства можно использовать как в отдельности,так и в смеси одно с другим. В качестве источника азота можно использовать различне неорганические или органические соединения, например мочевину, аммониевые соли (хло Б рид, сульфат, нитрат, ацетат, фосфат), илиприродные вещества, содержащие азот, например, кукурузную барду, дрожжевые или мясные экстракты, пептон, рыбную муку, бульоПитательные требования Штамм Сог упеЬас 1 епцгпд ц 1 апцсцгп МАТСС 13282 (исходный штамм) СогупеЬас 1 епцгпд 1 ц 1 агп 1 сцгп М2347 АТСС 21253 СогупеЬас 1 епцгп яцагп 1 сцгп М.9012279АТСС 21254 СогупеЬас 1 епшп дц 1 агпсцгп М 2234 АТСС 21255 Треонин СогупеЪасепцгпицагп 1 сцгпАТСС 14290(исходныйштамм)СогупеЬас 1 егшгпяц(агпсшпКУ 9494 АТСС21299СогупеЬас 1 епцгпиц 1 агпсшпКУ 10092 АТСС21300 Треонин + гистидин Треонин + лейцин 65 Гомосерин или треонин + ме. тионин, или треонин+ циста тионин, или треонин+ гомо. стени. Гомосерин или лейцин, илитреонин + метпонин - лей.цин, или треонин + цистатионин + лейцин, или треонин + + гомоцистеин + лейцин. Гомосерин + гистидин или треонин + метионин + гистидин, или треонин + цистатионин + гистидин, или трео. нпн + гомоцистеин + гистидин Гомосерин + изолецин + валинили треонин + метионин + + изолейцин + валин, или треонин + цистатионин + + изолейцин + валин. ны, гидролизат казеина и т. п. Указанные вещества могут применяться как в отдельности, так и в комбинации одно с другим,К числу минеральных солей относятся сульфат магния, фосфаты, натрия и калия, сульфаты железа и марганца, хлориды марганца и кальция, углекислый кальций, хлористый натрий и т. п. Однако при использовании такого сырья, как меласса, которое содержит некоторое количество неорганических веществ, ферментацию ведут без добавления их в средуКроме того, для продуцирования Ь-лизина в среду необходимо добавлять соответствующие аминокислоты, необходимые для роста микроорганизма. Можно использовать аминокислоты или смеси аминокислот, полученные из природных веществ.Предпочтительно применять различные виды белковых гидролизатов, например Миеки (торговое наименование гидролизата глутена или соевои муи, из которых удалена глутаминовая кислота), микробные гидролизаты, гидролизаты сои, пшеничной клейковины и т. и,Необходимое количество гидролизатов значительно меньше, чем количество исходных штаммов, Зто условие для предлагаемого способа.Процесс получения .-лизина по предлагаемому способу ведут в аэробных условиях при температуре 24 - 30 С (лучше при 30 С) и 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рН 5 - 8,5 (лучше при рН около 7,0), ПосЛевыращивания при этих условиях в течение 2 -5 дней в культуральной жидкости накапливается значительное количество 1.-лизина.По окончании ферментации Е-лизин отделяют от культуральной жидкости обычными способами, например обработкой ионообменнойсмолой, экстракцией растворителями, осаждением металическими солями, хроматографиейи т. п.Одной из важных особенностей предлагаемого способа является то, что попутно получают лишь небольшое количество 1.-валина, вто время как при использовании исходныхштаммов получают значительные количестваэтого вещества.П р и м е р 1. Среду, содержащую 5 г/дклмелассы (глюкоза), 0,05 г/дкл кислого фосфата калия, 0,05 г/дкл дикалийфосфата, 0,3 г/дклмочевины и 4 г/дкл Миеки, инокулируют СогуиеЬас 1 ег 1 цгп д 1 ц 1 аппсцгп М-2234 АТСС21255 и выращивают при аэробном встряхива.нии при 30 С в течение 24 час,3 л среды, содержащей 18 г/дкл мелассы(глюкоза), 4 г/дкл сульфата аммония и1,5 г/дкл Миеки, помещают в ферментер емкостью 5 л и стерилизуют. 500 мл засевнойкультуры высевают в ферментационную среду.При выращивании подают 3 л/мин воздуха,перемешивание ведут со скоростью 400 об/мин,при температуре 30 С, рН среды 6,8 - 7,0 (спомощью аммиачной воды). После 70 час выращивания концентрация Ь-лизина в культуральной среде составляет 48,7 мг/мл (в видегидрохлорида), выход по сахару составляет27,0 з/,. Концентрация попутного Ь-валина составляет менее 0,3 мг/мл. При выращиваниив таких условиях исходного штамма АТСС13287 концентрация 1.-лизина составила37,2 мг/мл, концентрация т.-валина 1,8 мг/мл.По окончании выращивания культуральнуюсреду отфильтровывают и обрабатывают сильнокислой катионообменной смолой обычнымспособом.П р и м е р 2. 3 л культуральной среды, содержащей 16 г/дкл сахарозы, 0,15 г/дкл кислого фосфата калия, 0,05 г/дкл дикалий в фосфата, 4 г/дкл сульфата калия, 0,05 г/дклсульфата магния, 0,002 г/дкл сульфата марганца, 0,02 г/дкл сульфата железа, 30 у/млбиотина, 120 у/мл метионина 30 у/мл треонина, 50 у/мл лейцина и 100 у/мл цистина,помещают в чашечный ферментер емкостью5 л и стерилизуют. 500 мл зародышевой культуры СогуиеЬас 1 ег 1 цгп д 1 ц 1 агп 1 сцги М-2347АТСС 21253, полученной предварительнымвыращиванием (пример 1), инокулируют вферментационную среду. Выращивание ведуттак, как описано в примере 1,После 70 час выращивания концентрация Ь- лизина в среде составляет 54,6 мг/мл (в виде гидрохлорида). Выход по сахару равен 34,2 . Концентрация попутного 1,-валина составляет менее 0,5 мг/мл.298132 Предмет изобретения Составитель Г. Голева Редактор В. Ф. Смирягина Техред Л. Л, Евдонов Корректор Л. Б. БадыламаЗаказ 1228/18 Изд.533 Тираж 473 ПодписноеЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Типография, пр. Сапунова, 2 В контрольном опыте при выращивании в тех же условиях исходного штамма СогупеЬас 1 епцгп дц 1 аппсцп 1 АТСС 13287 и без использования лейцина в исходной ферментационной среде концентрация У.-лизина составляет 42,1 мг/мл, концентрация попутного Е-валина составляет 1,7 мг/мл,П р и м е р 3. Выращивание ведут, как описано в примере 1, но в качестве зародышевого штамма применяют СогупеЬас 1 егцгп д 1 ц 1 ап 11- сцгп М-2279 АТСС 21254. Получают культуральную среду, содержащую 50,7 мг/мл /,-лизина (в виде гидрохлорида).Выход по сахару 28,1%П р и м е р 4. Выращивание ведут, как описано в примере 1, но в качестве зародышева штамма применяют СогупеЬас 1 егцгп о 1 ц 1 агп 1- сцп 1 КУ 9494 АТСС 21299. Получают культуральную жидкость, содержащую 53,2 мг/мл Ь-лизина (в виде гидрохлорида).П р и м е р 5. Выращивание ведут, как описано в примере 1, но в качестве зародышевого штамма применяют СогупеЬас 1 егцгп д 1 ц 1 ап 116сцп 1 КУ 10092 АТСС 21300. Получают культуральную жидкость, содержащую 51,6 мг/мл /.-лизина (в виде гидрохлорида). Способ получения 1.-лизина культивированием штамма СогупеЬас 1 епцп 1 дц 1 ап 11 сцгп в аэробных условиях в водной питательной сре де, содержащей источники углерода, азота,минеральные соли и необходимые аминокислоты, например в виде белкового гидролиза га, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода продукта, используют мутанты, полу ченные из штаммов СогупеЬас 1 епцп 1 дц 1 агп 1- сцгп МАТСС 13287 и АТСС 1429 б ультрафиолетовым облучением, например СогупеЬас 1 егцп 1 д ц 1 агпсцп 1 М-2347 АТСС 21253, СогупеЬас 1 егцп 1 о 1 ц 1 аппсцгп М-2279 АТСС 20 21254, СогупеЬас 1 епцгп д 1 ц 1 аппсцп 1 М-2234АТСС 21255, СогупеЬас 1 епцп 1 дц 1 агп 1 сцп 1 КУ 9494 АТСС 21299, СогупеЬас 1 епцп 1 д 1 ц 1 агп 1 сцп 1 КУ 10092 АТСС 21300.