Способ определения биохимических нарушений в рнк-азе l при вирусных и онкологических заболеваниях

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК АЗ 1838, 06,87, р.128 ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССРГОСПАТЕНТ СССР)(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ В РНК-АЗЕПРИВИРУСНЫХ И ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ В заявке раскрыт новый химический дефект в РНК-азе , а также способ определения указанного дефекта. Стабильная коррекция дефекта с помощью бз РНК в целом и неспаренных бз РНК в частности ассоциирована как с драматическими клиническими изменениями, такими как возобновление различных опухолей организмом, так и с восстановлением способности широкого спектра ингибировать различные вирусные и грибковые патогены, которые часто беспокоят как раковых больных, так и других индивидуумов в различных группах с высокой степенью риска,Лимфокины имеют ограниченную эффективность при контроле как опухолей человека (Сагтег ет а. Во. Вез. Мод., чо.4:613, 1985), так и вирусов человека (см. ссылки, приведенные в статье Моптейог асс МтсЬе, Ргос, Мат. Ьеаб. Яс. О.Я., чо.84, р. 2985, 1987). В попытке усилить их(57) Использование: онкология и вирусология. Сущность изобретения: Определяют биохимические нарушения в РНК-азе при вирусных и онкологических заболеваниях путем инкубации 28 Я и 18 Я РНК-азой , содержащейся в цитоплазматическом экстракте мононуклеарных клеток пациента, электрофоретическое разделение фрагментов РНК в полиакриламидном геле с последующим выявлением дефекта в ферменте по наличию зон специфического распределения полученных форограмм и дополнительно обнаруживают новые зоны расщепления в течение нескольких минут после инкубации. 4 ил. активность ученые искали сочетания этих природных полипептидов с другими различными соединениями.2-5 А Синтетаза: например (ЯозепЫогп апс Оццеггпап. Ргос. Ав. Аззос, Сапсег йезеагсп, чо, 26, МагсЬ 1985, раце 280), при сочетании интерферона (ИФН) с бз РНК наблюдается "высокая синергитическая антипролиферативная активность" на человеческой меланоме в культуре клеток при суб-эффективных концентрациях бз РНК и ИФН, взятых вместе.Однако, синергизм был "ограничен антипролиферативной антивирусной активностью ИФН", Наблюдалоь повышение в 2-5 олиго А синтетазе при попытке объединения, но признавалось, что "синергические антипролиферативные свойства этого сочетания не могут быть опосредованными через действие на 2,5 А", Напротив, повышенная 2-5 А синтетаза появляетсяпосле ИФН терапии с дним ИФН при лечении вирусной инфекции хронического гепатита В (СНВ) (Рогци е: а 13. 1 мег 1 егоп Вез чо 1. 7, раце 111).Однако в общем попытки использовать активность 2-5 А синтетазы в лимфоцитах периферического кровообращения (РВ 1) в качестве маркера для оценки до какой степени различные опухоли и вирусы являются чувствительными к лимфокинам оказались неудач н ы ми.Заявитель полагает, что это является случайностью, потому что 2 5 А синтетаза является только одним из ферментов, биохимического каскада, индуцируемого лимфокинами, и особенно потому, что 2 5 А синтетаза может оказывать антивирусное и противоопухолевое действие через активацию более позднего фермента в пути(ях), заканчивающемся РН К-азой 1.Недавнее описание очищенной 2 5 олиго А синтетазы показало, что она является очень нестабильной в присутствии г 1 з РНК (Колпак эпг 1 Вагпе 3. 1 птег 1 егоп Вез., но 1. 7, р. 231, 1987).Заявитель обнаружил новую роль с 1 з РНК в отношении коррекции различных нарушений в РНК-азе 1, что как также показано заявителем, является терапевтически важным для успешного лечения рака, иммунологических и вирусных заболеваний.РНК-аза 1:РНК-аза 1 в активированном состоянии ассоциирована со специфическим расщеплением вирусной РНК и, по-видимому, оберрантные клеточные РНК ассоциированы с фенотипом злокачественной клетки (неконтролируемая пролиферация),В недавней публикации (1 апсе 1 1987 г чо 1. 1, р. 1286) заявитель описал различные дефекты в РНК-азе 1, вторичные к выработке ингибитора НИ (вируса человеческого иммунодефицита) РНК-азы 1. Заявитель разработал успешный терапевтический режим, который заключается в графике дозирования бз РНК, который позволяет как при прямом, так и непрямом механизмах действия вытеснятьингибитор НИиз РНК-азы 1, приводя в результате к улучшению клинического состояния пациента и снижению нагрузки НИ.Изобретение иллюстрируется следующими рисунками и примерами,На фиг, 1-3 представлены фотографии пластин электрофореза в полиакриламидном геле, показывающие указанное количество треков и полос или зон, соответствующих продуктам расщепления специфического Р Н К-азой 1 вдоль каждого трека; нэ 4 иг, 4 - график из трех частей, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Терапевтические методы лечения раков, особенно имеющих опухолевые клетки, устойчивые к лечению одним интерфероном, и вирусных состояний, включая заболевания, вызванные членами семейства ретровирусов, также описаны,В ранее цитированной статье из 1 апсес образцы РНК-азы 1 от индивидуумов, зараженных НИ, не показывают какой-либо детектируемой биоактивности. В частности "ЯСР" зоны, т,е. зоны продуктов специфического расщепления, лишены фрагментов РНК, которые показывают, что РНК-аэа 1 у этих пациентов была эффективно инактивирована ингибитором, В противоположность этому, у здоровых нормальных субъектов 1 п что активированную РНК-азу 1 обнаружить очень легко, Следовательно, отклонение от нормы РНК-азы 1 в человеческих опухолях ассоциировано с новыми продуктами расщепления (М СР).Новые продукты расщепления (К СР) отличаются от продуктов специфического расщепления (Я СР) и идентифицируются человеческими клетками без нормальных механизмов контроля роста клеток и пролиферации вируса.На фиг.1 показана кинетика активности РНК-азы 1, полученной иэ периферических лимфоцитов нормального индивидуума, подобно Полосе 2 из указанной выше статьи заявителя (1 апсес). Как описано ранее, аналитический метод заключается в измерении акти ви рован ной Р Н К-аэы 1 в цитоплаэматическом экстракте мононуклеарных клеток путем определения способности генерироимеющих отношение к трем различным пациентам, где сравниваются количества белых кровяных клеток (линия, соединяющая кружки) с количеством 2-5 А синтетаэы (линия, соединяющая треугольники) в зависимости от времени лечения.Изобретение включает диагностические процедуры для оценки дефектов и биохимических нарушений в РНК-азе 1 и может быть использовано для коррекции таких дефектов, с помощью дз РНК, предпочтительно неспаренной г 1 з РНК, назначаемой необязательно до или конкурентно с введением лимфокина, такого как интерферон или интерлейкин.Процедуры определения наличия недостатка характерных продуктов расщепления РНК-азой 1 в образце крови пациента, в частности в мононуклеарных клетках пациента, и использование наличия и/или времени образования таких продуктов расщепления в качестве маркера для начала лечения с помощью с 1 з РНК также описаны, 1838419вать продукты специфического расщепления при инкубации с источником 28 3 и 18 Я РНК. Примененные процедуры соответствуют описанным К,Каг 1 ко апс .1.10 ба 19, В ОсЬещ, ВорЬуз 1 сз. Везеагсй Согпацпсат 1 оп, чо 1, 128, 695, 1985 и учгезсйпег ет а 1, Носе 1 с АсЫ ВезеагсЬ, чо 1, 9, 1571, 1981. Рибосомальная РН К получена из Н 929 клеток, которые генетически утратили РНК-азу 1.ЭтиН 929 клетки депонированы в соответствии с Будапештским договором в Коллекции американских типовых культур, Рокквилл, Мэрилэнд, США под номером АТСС М СК 1 9659,При наблюдении в течение продолжительного периода времени 1700 минут (около 26 ч) заявитель обнаружил, что РН К-аза от нормальных индивидуумов в некоторых случаях способна образовать й СР (Полоса 8 на фиг. 1). Отметим, что самая ранняя точка детекции И СР у нормального индивидуума отмечается после многих часов инкубации.Однако М СР видны в течение нескольких минут инкубации РНК-азы 1, когда используют лимфоциты от пациентов с лейкемией, Это четко показывает фиг.2, когда клетки от 3 лейкемических пациентов(пациенты А и В с хронической миелогенной лейкемией СМ) сравнивают со сравнимыми от нормального индивидуума, пациента С. Отметим, что у пациента с лейкемией (пациенты А и В, фиг.2), Я СР никогда не видны, а М СР видны после такой короткой инкубации, как 1-4 мин, Поразительный контраст наблюдается у нормального индивидуума (доброволец, обозначенный С), только Я СРи нет никаких И СР видны в кинетических образцах, выдержанных до 60 мин.Следовательно, наблюдается ранее недетектируемая биохимическая аномалия, с которой ключевой фермент (РНК-аза ), ассоциированный с механизмами защиты организма против рака, иммунологических и вирусных заболеваний, работает ускоренным и, по-видимому, неконтролируемым образом, В отдельных экспериментах проведено сравнение относительных способностей двух различных клеток (клетки с аномальной РНК-азой 1) отклонять вирусное заражение. Было обнаружено, что титры потомства, вирусов были значительно выше у клеток с аномальной активностью РНК-азы, которая так быстро генерируют Й СР.Заявителем продемонстрировано и описано как двунитевые РНК, особенно не- спаренные, нарушают нормальную кинети 50 55 5 10 15 20 25 30 35 40 45 ку РНК-азы и продуктов расщепления и что скорость нарушения функции бз РНК может быть увеличена предварительной экспозицией с лимфокинами.Под "неспаренными бз РНК" понимают те РНК, у которых водородные связи между нитями являются относительно интактными, т.е, прерываются в среднем не менее чем на одной паре оснований в каждых 29 последовательных остатках оснований, Термин "неспаренная сз РНК" следует понимать соответственно. бз РНК могут быть комплексом полиинозинэта и полицитидилата, содержащим некоторое количество оснований урацила или гуанидина, например, от 1-5 до 1 в 30 таких оснований (поли 1 поли (С 4-29 хИ или 6), АльтЕрнативнО, СООтвЕтетвующие олигонуклеотиды (маленькие фрагменты нуклеотида) могут быть комплексно связаны с соответствующими комплементарными полинуклеотидами или олигонуклеотидами в определенных условиях,с 1 з РНК могут быть поли 1 поли С, О, в которых отношение С к О составляет примерно 13 к 1. а коэффициенты седиментации поли 1 и поли С, О оба менее 9 и в пределах 2 единиц для каждого, и оба предпочтительно около 6,5-7,5,РНК могут иметь общую формулу г 1 п г(С 1 и 4, О)п и специфически г 1, г(С 12, О)п. Другие подходящие примеры с 1 з РН К описаны ниже.Неспаренные бз РНК, предпочтительные для использования в настоящем изобретении, основаны на сополинуклеотидах, выбранных среди поли (Сп, О) и поли (С, 6), в которых и является целым числом, имеющим величину от 4 до 29, и являются неспаренными аналогами комплексов полирибоцитидилата (гС,), например путем в кл ючен ия 2 -0-метил ри 6 озил ьн ых остатков. Эти неспаренные аналоги г 4 г и,с предпочтительными среди которых являются аналоги общей формулы г 4 г и, описаны Сапег апс Рз 0 в патентах США 4 130 641 и 4 024 222. Описанные там с 1 з РНК обычно пригодны для использования в соответствии с настоящим изобретением,Конкретные примеры неспаренных с 1 з РНК для использования в соответствии с изобретением включают; пОлипОли (С 4 И) пОли , пОли (С 7 И) пОли (1), пОли (С 13, И) поли , поли (С 22, И) поли (1), поли (С 20 6) поли (1), поли (С 29, 6) и поли (1), поли (Ср)236 р,Количество введенной неспаренной бз РНК предпочтительно является достаточным для достижения пика концентрации в крови от 0,1 мкг/мл бз РНК до 100 мкг/мл в системном кровообращении сразу после дистального введения от точки инфузии.Три индивидуума, о которых было сообщено ранее, с лейкемией (СМ 1), продемонстрировали новый дефект РНК-азы.в ассоциации с неконтролируемым ростом у них клеток злокачественной опухоли и значительным клиническим ухудшением (недомогание, потеря веса, неспособность противостоять многочисленным инфекциям) при различных сопутствующих вирусных инфекциях, включая герпес зостер, СМЧ ЕВЧ, герпес симплекс или гепатит. Некоторые пациенты также страдали хроническими грибковыми инфекциями рта.Заявителем оценено как новое биохимическое расстройство, так и разработана схема введения бз РНК, одной или в сочетании с лимфокином, которая эффективно корректирует аномальность РНК-азыи в результате проводит к значительному клиническому улучшению, характеризующемуся значительным снижением тяжести опухоли и значительным улучшением общей антивирусной и иммунологической защиты как доказательства снижения взаимопротекания вирусных и грибковых инфекций,Лимфокины включают интерфероны (альфа, бета, гамма), предпочтительно интерферон альфа, интерлейкины, особенно интерлейкины (1, 2 или 3) и рекомбинатный интерлейкин(р 1-2), и фактор некроза опухоли (ФНО). Также включены активированные лимфокином киллерные клетки (клетки-убийцы) ( АК), образующиеся у животных в ответ на обработку лимфокином.При использовании интерферона (альфа) в качестве лимфокина должно быть обеспечено количество от 0,01 до 100000 МРЕ/мл жидкости тела пациента.Когда лимфокином является 1-2, предпочтительно р 1, доза лежит в интервале от примерно 10 1-2 единиц/кг массы телагпациента до величины (достигающей неприемлемых уровней токсичности у такого пациента) 10 1-2 единиц. Однако наиболее эффективными и допустимыми с точки зрения токсичности величинами являются величины в интервале от примерно 10 доз примерно 10 1-2 на кг массы тела.4При введении обоих агентов, бз РНК и лимфокина, как описано ранее, они могут быть введены в виде смеси или раздельно, но одновременно или последовательно.Введение бз РНК и лимфокина "в сочетании" включает случай, когда оба агента 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 введены вместе в виде терапевтической смеси, а также процедуры, в которых оба агента вводят раздельно, но одновременно, например через отдельные внутривенные вливания одному и тому же индивидууму. Введение "в сочетании" также включает отдельное введение одного из лекарств, при котором одно из лекарств дается первым, а затем после короткого перерыва - второе,На фиг,3 показан типичный случай биохимического восстановления у 3 пациентов (ТАТК, ДЕГД, ДА 1 К), сначала подвергнутых действию низкой дозы лимфокина (альфа И Ф Н в дозах 0,5-3,0 миллиона МРЕ/4-7 раз в неделю).Каждый пациент весил около б 0 кг. Отметим, что в каждом случае введение одного лимфокина было явно недостаточно, чтобы вызвать любое детектируемое улучшение в дефекте РНК-азы, Все пациенты показали только М СР, когда получали только лимфокин. Пациент (ДАЩ имел короткий период ответа на традиционную химиотерапию (гидроксимочевина и т,п.), во время которой его лимфоциты временно вновь приобретают Я СР активность; однако его заболевание дает рецидив с превращением из Я СР в М СР, ассоциированный во времени с клиническим ухудшением, и он получал лимфокин с измеряемым клиническим или биохимическим улучшением, В каждом случае, в котором затем была введена бз РНК в сочетании с лимфокином, резкое клиническое улучшение и восстановление биохимической нормы РН К-азыпроисходило по-видимому одновременно.На рис. 3 показана эффективность неспарецчой оз РНК г 1 г(С 11-14) или АМПЛИГЕНа/торговое название НЕМ йезеагси, Роккевилл, Мэрилэнд, США), даваемой в интервале доз от 40 до 300 мг (вводится внутренно дважды в неделю). Наблюдалось достижение подобных клинических эффектов путем контроля фермента (РНК-азы ) и введением одной неспаренной бз РНК, но при этом требовалось часто в 2-20 раз большее количество, а начало клинического отвеста значительно задерживалось,При сочетании анализа на РНК-азуи разумного использования неспаренной РНК, одной или в сочетании с лимфокинами, создается возможность стойкого улучшения общего клинического состояния (снижения вирусных и грибковых инфекций), тогда как тяжесть опухоли существенно снижается (как показано на фиг,4, обсуждается ниже), Важно, что теперь имеется возможность вызвать эти значительные клинические изменения на основе стоимость/эффект, а также свести к минимуму, если не устранить, ток 1838419 10Сичность для пациента этих реагентов. Таким образом данное изобретение является широко применимым с различными лимфокинами, а также с большим семейством двунитевых РНК, которые без разработанной 5 Стратегии могли бы лишь в незначительной Степени использоваться в клинике.График на фиг,4 иллюстрирует резкие биохимические и клинические эффекты, доСтигаемые на 3 пациентах с лейкемией, для 10 которых профили Р Н К-азыприведены на фиг. 3. На фиг.4 представлены графики зависимости от времени количества белых кровяных клеток (клетки на кубический миллиметр, представлены соединенными "о"), и 15 активность 2 -5 А синтетазы периферичеСких лимфоцитов (представлены соединенными треугольниками). Для выделения Лимфоцитов для измерения 2-5 А синтетазы приблизительно 1 х 10 мононуклеарных 206клеток в периферическом кровотоке сначала очищают с помощью стандартной методики Фикло Гипак. Во всех трех случаях прежняя химиотерапия или прежняя терапия лимфокином дала очень ограниченную 25 пользу, как доказывается высоким количеством белых кровяных клетокО/ ВС), например, более 3000 на мм, и низким содержанием 2-5 А синтетазой, выраженной в наномолях/мг клеточного белка, Од нако неспаренная бз РНК, добавленная к клеткам, которые сначала были "обработаны" низкой дозой лимфокина, показала конкурентное восстановление в ряде циркулирующих опухолевых клеток (счет И/ 35 ВС), возвращая к нормальному состоянию РНК-аэулимфоцита и улучшая общее антивирусное состояние,Клиническая эффективность таких режимов дает необычно большую продолжи тельность и у некоторых пациентов в конце концов может встретиться строгий клинический критерий "вылечивание". Заявителем оценена эта возможность неарелевантной животной модели, на которой показано не только ингибирование роста опухоли, но повышение выживания (р 0,001) при схеме лечения бз РНК; одной или в сочетании с лимфокинами, исходя из относительного уровня РНК-азыи оживления всего пути 2-5 А (синтетаза) РНК-азытакже отмечается, что такое лечение увеличивает природную иммуновыживаемость (М К клетки, 1 АК клетки и т,п.), а также является непосредственно благоприятными для снижения числа жизнеспособных опухолевых клеток,Дополнительные подтверждающие исследования указывают, что эти режимы лечения, а именно, бз РНК, одна или в сочетании с лимфокинами, действительно придают различными опухолевыми клетками большую чувствительность к лизису, даже хотя сами лимфокины обычно не повышают эффективно чувствительности опухолевых клеток-мишеней, кэк и не дает резкого усиления иммунной функции. Формула изобретения Способ определения биохимических нарушений в РНК-азепри вирусных и онкологических заболеваниях, предусматривающий инкубацию 28 Я и 18 Я РНК с РНК-азой 1, содержащейся в цитоплазмэтическом экстракте мононуклеарных клеток пациента, электрофоретическое разделение фрагментов РНК в полиакриламидном геле и идентификацию дефекта в ферменте по наличию зон специфического распределения на полученных фореграммах, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что на фореграмме дополнительно выявляют новые зоны расщепления спустя несколько минут после инкубации.+ Ф + - + + + --- + + + 60 Фиг. 4Техред М,Моргентэл Редакто рректор И,Шмако Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 10 Заказ 2906 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5