Способ лечения патологических состояний, сопровождающихся нехваткой gt рнк

комитет Российскпо патентам и това едерации тм знакам(05)НИЯ ПАТООВОЖДА ГИЧЕСКИХ ЩИХСЯ НЕи(71) Хем Рисерч Инк(73) Хем Рисерч Инк(ю) К 0 (и (51) 5 С 07 Н 11 тения: для про вождающ человека вв честве 1 - 1 При этом п собой компл содержаще гуанидиновы связей и соо лечения патологических состоянии, соихся нехваткой дт РНК в организме одят пожноспаренную дт РНК в копи мкг/1 мм биологической жидкости. ожносларенная дт РНК представляет екс полиинозината и топицитидилата го от 1 на 5 до 1 на 30 урациловых или х оснований включает районы разрыва тветствует формуле г 1 хт(С )хал 11-14ложноспаренная дтРНК в комбинации с Гй, Этот пациент не мог индуцировать активность 2 - 5 А синтетазы, получая один ГМ, но показал существенный рост активности этого медиатора при комбинации ГМ и ложноспаренной дтРНК. Индукция 2-5 А синтетазы сопровождалась полной гематологической ремиссией, которая продолжалась несколько месяцев после мимолетного увеличения клеток крови, вызванного прерыванием предшествовавшей химотерапии, Измеряли также активность РНКазы и обнаружили, что она была в 10 - 100 раз выше нормальной (фиг, 3, дорожка 1), давая продукты расщепления п чтго, которые представляют собой дальнейшую деградацию обычных продуктов расщепления РНКазы, Активность РНКазы вернулась к нормальным значениям и профиля расщепления после 30 дней терапии комбинацией ГИ/дтРНК(фиг. 3, дорожка 2), Этот вид ответа наблюдается регулярно,П р и м е р 2. Вирусная инфекция Т 4 клеток.Другое состояние нехватки дтРНК такое, при котором сам животный вирус (или его реплакативный интермедиатор) обеспечивает ингибирование активации медиаторов дтРНК или частично биоактивный дтРНК, хотя ГМ и его медиаторы индуцированы вирусными инфекциями. В эту категорию попадают многие вирусы, ассоциированные с хронической симптоматологией у хозяина, Инфекция Т 4 клетки ВИЧ также может представлять такую ситуацию, как предложено на фиг, 1. Репликация ВИЧ в Т 4 клетках эффективно блокируется ложноспаренной дтРНК в культуре ткани (Европейский патент 0.213.921) несмотря на тот факт, что репликация ВИЧ в этих же клетках только умеренно подавляется ОГМ- альфа, -бета, или -гамма отдельно или в физиологических смесях. Поскольку сама РНК ВИЧ демонстрирует существенную вторичную структуру, которая не блокируе ее собственную экспрессию, разные дтРНК, возможно, вызывает разные биологические ответы. Один район развитой структуры дтРНК на 5-конце мРНК ВИЧ связывает полипептид с ч 150000, предположительно транслирующий ВИЧ белок (тай)(Моеэпд ет а, Се, ч.48, р,691, 1987). Ложноспаренная дтРНК может конкурировать с РНК ВИЧ за белок 1 ас. Свойство поддерживать эффективную инфекцию ВИЧ, так же как и другие хронические виремии, может быть другим состоянием нехватки дтРНК при СПИД и ССК.П р и м е р 3, Клетки, инфицированные ВИЧ. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Третий тип состояния нехватки дтРНК наблюдался в лимфоцитах крови индивидуумов с хроническими вирусными инфекциями, такими как ВИЧ при СПИД и ССК. Ргео 6 апет(Л, Месг. 0 з, ч.152, 1985) сообщали, что эти клетки демонстрируют повышенный уровень дтРНК-зависимой 2-5 А синтетаэы. Этот результат был типичен для серии последовательных ССК и СПИД-пациентов, которые были изучены. Основа изобретения - центральная роль дтРНК в хозяйском выздоровлении и необходимость замещения состояний нехватки дтРНК подходящим источником экзогенной дтРНК,РНКазы часто истощена у пациентов с СПИД и ССК (Лопе 6, 1987, ТЬе апсес), однако РНКаза. может восстановиться до более нормальной активности после нескольких недель терапии ложноспаренной дтРН К в некоторых случаях. Как предполагает фиг. 3, колонка 4, экстракты С С К-лимфа цито в могут ин гиби ровать активность нормальной РНКазы при некоторых условиях. Поскольку экстракты ТХУ и эталоны не имеют ингибиторой активности, ингибитор, наблюдаемый в ОЯК ССК-пациентов и допускающий передачу, может быть описан Р/1 апз ет а в герпес-индуцированных клетках (чго ду, Ч. 151, р,233, 1986). Также не обнаружены ингибиторы в экстрактах ОЯК от здоровых индивидуумов (дорожка 5), изученных на сегодня.Поскольку ложноспаренная дтРНК прямо воздействует на эти клетки, они должны быть также дтРНК-дефицитными. Следовательно, разные дтРНК имеют различные биоактивности (дтРНК ВИЧ являются ингибитором, в то время как дтРНК - нет). Похоже, что лимфоциты пациентов с ССК и СПИД дтРНК дефицитны в том смысле, что выполняются только некоторые иэ необходимых дтРНК зависимых функций. По крайней мере одна функция - поддержка существенного уровня биоактивной РНКазы. не выполняется, если не добавлена экзогенная дтРН К.П р и м е р 4, Синдром хронической усталости,Пример нехватки дтРНК, требующей подходяцей заместительной терапии, - синдром хронической усталости (СХУ). Это состояние, охватывающее 10 - 12 миллионов американцев, трудно в диагностике: всеоб. щее расстройство, характеризуемое экстремальной утомленностью, увеличением лимфатических железок и такими констициональными симптомами, как потеря веса, потеря аппетита и т.д. Состояние возникает преимущественно у молодых, активных людей, Поскольку некоторые пациенты с СХУдемонстрировали нейропсихиатрические изменения, такие как депрессия, потеря памяти и сходные расстройства, синдром хронической усгалости иногда трудно отличим от полностью нейролоических расстройств, в частности депрессии. Различные лабораторные исследования показывают, что у индивидуумов имеющих синдром хронической усталости, могут реплицироваться многие вирусы, и что такие люди становятся в реультате вирусными помойками", У таких индивидуумах часто присутс 1 вует вирус, ретроеирусы, вирусы герпеса и т,п.Концентрацию молекул 2 - 5 А и Ичо, биохимически связанное. аккуратное измерение внутриклеточных уровней дтРНК у субьектов с синдромом хронической усталости проводили следующим образом; этанолрастворимые фракции образцов от пациентов (очищенных на ВсоИ - Нурадое лимфоцитах периферической крови) анализировали на содержание в них 2-5 А е анализах с 2 - 5 А кор-целлюлозой (аффинная хроматография) с поли О-(р)-рСр. В этом анализе способность 2 - 5 А-актеированной РНКаэы. гидролизовать поли/У/ использовали для определения концентрации функциональнойй 2-5 А.Относительно уровни были определены тестированием 15-нормальных субъектов, не переносящих вирусные инфекции, судя по отсутствие жара, отсутствию конституциональных симптомов, сыпи и т.д. Уровни концентрации 2-5 А е их лимфоцитах определяли, используя калибровочные кривые, полученные с истинной 2-5 А, Относительные уровни нормальных индивидуумов, выраженные в виде наномолей 2 - 54, варьирует от 0,3 до 1,1 нмоль/г клеток ОКПК.С использованием этого метода анализа было проверено десять пациентов, проявляющих обычные симптомы синдрома хронической усталости, и были получены следующие результаты:Пациенты с синдромом хронической усталости имеют е общем менее 0.1 и менее примерно 0,2 нмоль 2 - 5 А/грамм белка лимфоцитов. Решительная обработка таких индивидуумов с синдромом хронической усталости обеспечена подачей экэогенных дтРНК до тех пор, пока внутриклеточный уровень 2-5 А олигонуклеотидов не достигнет нормы, показывая возвращение внутри- клеточного уровня дтРНК к норме и/или до устранения клинической симптомологии пациента. Устойчивость пациента к синдрому хронической усталости и сопутствующим вирусам поддерживается продолжением измерений уровня енутриклеточных 2-5 А олигонуклеотидое пациента и подачей экэогенной дтРНК по мере потребности для поддержания уровня 2 - 5 А в нормальном 5 диапазоне, обычно более чем 0,2 нмоль 254 на грамм белка лимфоцитое.Природная дтРНК играет роль в хозяйской защите при борьбе с такой вирусной болезнью, как синдром хронической устало сти, Специфическое уменьшение количества биоактивной дтРНК или ферментов, которые зависят от дтРНК, в особенности вирус-ассициированный имгибитор РНКвэы, сочетающийся с ненормально низкими 15 уровнями 2-5 А в лимфоцитах периферической крови, внутри специфических клеток, вносит вклад в развитие болезни. дтРНК, в особенности ложноспвренная дтРНК. обращает развитие болезни.20 Пациенты,имеющие синдром хронической усталости, обработаны внутривенными введением от 200 до 6 ОО мг в зависимости ог тяжести болезни и вирусной нагрузки (г 1 г/Си, О) дважды в неделю. Повыше ние уровня 2-5 А ассоциировано с клиническим улучшением, При опрвдвлении оличестеа применяемой цтРНК и частоты применения руководствуются измеренными уровнями 2-5 А в сочетании с клиниче- ЗО скими улучшением пациента. Количествопримененной дтРНК обеспечивают уровень от 0,01 до 1 микрограмма дтРН К на милли- литр системной циркуляции крови пациента сразу после применения при измерении в 35 точке, удаленной от места введения.П р и м е р 5. Антивирусный эффект нвпопуляциях Т 4 клеток.Экзогенно примененная ятРНК, в частности ложноспареннвя дтРНК, восствмав лиеает способность пациента отвечать нввирусную угрозу. В качестве вирусного состояния был выбран ВИЧ как один из наиболее опасных. Первичная мишень инфекции ВИЧ-Т 4 лммфоциты и мх гюпуля ция резко уменьшается с прогрессией вирусной инфекции. Далев уменьшение популяции Т 4 клеток - нежелательный, количественно оцениваемый параметр болезни, чье уменьшение отражает ухудшение в 50 болезни. Увеличение же популяции Т 4 клетки - предпочтительное диагностическоесвидетельство, показывающее улучшениепри терапевтическом вмешательстве.Нормальная популяция Т 4 клеток у здорового индивидуума - 400 клеток на кубический миллиметр крови. Были проведены измерения у 31 пациентов (см. фиг, 4), диагностированных как находящихся в преССК или ССК состояние, они были разделены на три категории по абсолютному числу Т 4клетки на мм крови: а) более чем 300 (18 пациентов, данные не приведены), б) 150- 300 (13 пациентов) и в) менее 1500 (8 пациентов, среднее - 92). Пациенты из группы б) и в) были обработаны 100 - 200 мг г 1 (С 12 О)/АарПрепй дважды в неделю путем внутривенного введения в течение 3-16 месяцев (в среднем 8,4 месяца), В целях сравнения данные о популяциях Т 4 клеток необработанных ВИЧ инфицированных пациентов (181) включены (соединенные треугольники) для того, чтобы показать неизбежное в противном случае снижения популяции Т 4 у таких индивидуумов.Нулевая линия - это начальная абсолютная концентрация Т 4 лимфацитав до начала терапии, Улучшение выражено в виде процентного изменения (позитивнага или негативного) от этой нулевой линии и показано на фиг,4. Пациенты были первоначально обследованы и измерена концентрация Т 4 клеток. Группа пациентов б), показанная на фиг, 4 линией, соединяющей светлые кружки, имела концентрацию клеток Т 4 в пределах 150-300 кл./мм . Эти пациенты получали снвчала 100 мг Авр 119 еп (внутривенно дважды в неделю) в виде безопасного количества и их обследовали на неблагоприятные реакции, затем была увеличена дава до 200 мг, применяемая с тай же частотой, Вторая группа пациентов б), чья концензтрвция Т 4 клеток была менее 150 кл/мм, гаяучэла 300 мг Авр 119 еп (внутривенно дважды в неделю). Процентные изменения от нуяевой линии показана в виде линии, соединяющей темные кружки. У необработанных пациентов (181) абсал ютнэя концентрация Т 4 лимфоцитав продолжала резко уменьшаться, как показано линией, соединяющей треугольники.Среднее количество Т 4 клеток увеличивалось на 3/4 после 4 месяцев у 30 пациентов, нв 8 после 8 месяцев у 10 пациентов и на 17% после 12 месяцев у 8 пациентов. Только 2 пациента (среднее количество Т 4 клеток 82 клетки) продвинулись к СПИД, получая длящуюся терэпиа г 1 в (С 12, О)п, и еще у пациента с ССК, который прервал терапию на 2 месяца, развилась саркома Капоши.Эти данные демонстрируют, чта инфицированные индивиды, чьи абсолютные уровни Т 4 лимфацитав ниже чем 150 кл/мм, требуют существенные количества лекарства для замедления темпа убывания Т 4 клеток, однако пациенты в интервале 150-300 эффективно поддерживаются при меньших дозах. Эти данные также подчеркивают важность начала терапии да крутого спада я састочнии пациента ВИЧ. Эти данные двманстрируат также прямую связь междустепенью нехватки 9 тРНК, определеннойкосвенна, на точно па абсолютной папуля 5 ции Т 4 клеток, и количество экзагеннай9 тРНК, требующейся для коррекции нехватки и восстановления полного здоровья (ввиде восстановления популяции Т 4 клетокда уровня, приближающегося у уровню ме 10 нее тяжело инфицированных и неинфицировэнных индивидуумов), Чем большенехватка Т 4, тем большее количество дтРНКтребуется для восстановления нехватки,П р и м е р 6, Заместительная терапия15 стРНК при пэрэмиксавирусной инфекции,,Цругай пример преходящей нехваткидтРНК, требующей подходящей замести 1 ельнг 1 й терапии, - различные фазы жизниноворожденного и развития ребенка, у ко 2 С юрага иммунная система тела не полностью развита. В этих случаях могутвозникать потенциально опасные для жизни инфекции, из которых могут возникнутьсамалитирующие инфекции в юности и25 взрослом состоянии, Следует частный пример; члены семейства парамиксовируса, такив как респираторный синцитиальныйвирус (РС В). могут вызывать острый бронхиолит у детей (обычна б - 18 месяцев) с вще не30 полностью развитой иммунной антивирусной системой защиты. В таких случаях эаместительная терапия 9 тРНК гв(С 12, О)лможет быть круциальнай и прерывать та, чтов противном случае может привести к ле 35 тальнаму событию,Для развития этого нового пониманиявыращена линия клеток человека, полученных из эмниана, обозначенная СС 25 пристэндэптных лабораторных условиях, Клет 40 ки СС 25, галученные из Атег 1 сап ТуреСЮ 1 цге СаИесОап Вас 1 чШ, Магуап 9, ОБА,поддерживают рост и репликацию РСВ темже образом. чта и человеческие ткани бранхиал новорожденных. Табл. 4 убедительно45 демонстрирует, чта возможна снижениемультипликации РСВ приблизительно на99 ф, используя дозы 9 тРНК, которые хороша переносятся людьми.Мат эы.50 РНКэзы 1. очищенные от экстрактов (в100 мкг белка) ОКПК ат здоровых индивидуумов или из клеток 1929, инкубиравали приусловиях кар-целлюлазнага анализа в присутствии поли(О) ( Р)рСР (11000 расп./мин,55 0,1 мКи,/ммаль) или пали(С)(Р(рСР(12400расп./мин, 0,3 мКи/нмаль) после добавления истинной 2-5 А (РЗА 4, 5 х 10 ) или 2-5 А,выделенной из экстракта (12,5 мкг белка)ОКПК ат пациента 5 (на 9 неделе терапиилажнаспареннай 9 ТРНК), поли(О)( Р)рСр ивания аутопсией, проведенные на неотобранных пациентах, т,е, непредвзятый отбор пациентов в противоположность исследованиям бопсией на пациентах с гепатомега лией и тестом на повышенную функциюпечени, всегда демонстрируют широкую интергепатическую патологию. Приблизительно 80-90 всех случаев аутопсии на пациентах со СПИД демонстрируют ано мальную анатомию печени, Печеночныеаномалии включают закупорку сосудов, воспаление ворот, ожирение, фокальный некроз, гранулематоэ, желчное состояние, цирроз и гиперплазию Купферовских клеток 15 в приблизительном порядке частоты, Интересно, что в одном исследовании (ЯсМеЫегтап ет а, Аппаз псегпа Мед, чо.105, р.207, 1987) интергепатический диагноз саркомы Капоши на аутопсии был наиболее 20 распространенным специфическим интергепатическим патогеном (1 8).Желчная болезнь к настоящему времени описана у небольшого числа пациентов со СПИД. В виде единичных случаев описа ны склеротический холангит, интрагепатические деструктивные нехватки желчных протоков и доброкачественная экстрагепатическая закупорка желчи на пациентах со СПИД, В этих случаях не было отмечено ЗО специфического этиологического агента;цитомегаловирус был привлечен в качестве возможной причины, вторичной к гистопатологическим находкам на биопсии, У пациентов со СПИД с доброкачественной 35 экстрагепатической желчной закупоркой,обычно присутствуют жалобы на печень, боли в правом верхнем квадранте и умеренный подьем билирубина. На аутопсии или лапаратомии был поставлен диагноз ампул 40 с водой - структуры, вторичной к фиброзу.В двух случаях экстрагепвтической закупорки из желчного древа были выделены криптоспоридии. В других случаях привлекали внимание тельца включения цитомегалови руса вблизи от ампул с водой, Как и в описанном выше случае интрагепатического холангита, специфическая этиология неизвестна и специфические патогены могут играть только нерегулярную роль в патогенезе 50 этих расстройств. поли (С) ( Р)рСР синтезировали из поли (У) или поли (Ц) (39 гпа) и ( Р)рСр (АгпегзЬат) при помощи Т 4 лигазы (Вейезса Везеагсй зЬога 1 огез). В контрольных экспериментах в отвутствие РзА 4 на фильтрах из стекловолокна задерживалось 3300 расп./мин гули(О)( Р)рСр и 11000 расп./мин поли(С) ( Р)рСр, что отнесли к отсутствию (Оф 4) деградации.Поскольку установлено, что образование инфекционных центров, индуцированных РСВ, включает прямое распространение вируса от клетки к клетке, просто повышением внутриклеточной дтРИК можно эффективно снижать распространение РСВ от клетки к клетке без значимых неблагоприятных эффектов для других тканей тела..Таким образом, болезненная патология, вызванная потенциально самолимитированными патогенами, такими как РСВ (семейство парамиксовирусов) и другие РНК-образующие вирусы, которые поражают назально (трахеально) бронхиальное древо, таких как риновирусы или вирусы гриппа, может быть эффективно сдержана по механизму заместительной терапии дтРНК. Локальные входные ворота патоге" на, такие как воздушные пути (не ограничиваясь ими, могут иметь присущие или преходящие низкое содержание утРНК (9 тРН К здесь определяется по способу действия как любая из тех молекул, которые включают уместные иммунные антивирусные защитные каскады для пресечения репродукции патогена /патологии ткани).П р и м е р 7. Обработка гепатита, Многочисленные наблюдения болезней печени со СПИД появились в литературе в течение последних 2-3 лет. Тема, к которой неоднократно обращаются, - это широкий массив гистологических находок как в образцах биопсии, направляемых иглой,так и биопсии во время аутопсии, Во всех исследованиях, упомянутых ниже, удовлетворены критерии диагноза СПИД Центра США по борьбе с болезнями, Атланта, Джорджия, США. Обычно присутствующие симптомы и черты пациентов, у которых обнаружена обширная болезнь печени, в целом неспецифичны и включают потерю веса, лихорадку, лимфоденопатию, гепатосплиномегалию и боли в животе, У большинства пациентов со СПИД обычно повышены сериновые трансаминазы. У повышенных щелочных фосфа тах существует склонность быть непропорционально высокими. Предполагается, что такое увеличение щелочной фосфатазы коррелирует с гистологическим диагнозом гранулемной болезни, ИсследоВведение 9 тРНК гл г (С 120)п 200 мгдважды в неделю внутривенно исправляет или существенно улучшает основные кле точные аномалии, ассоциированные с мультипликацией вируса гепатита в (ВНВ). Для завершения этого утверждения был использован следующий способ.Определение уровня ВГВ-специфической ДНК в сыворотке или плазме, Присут 28272001917ствие связанной с сывороткой (или плазмой) ДНК ВГВ - индикатора присутствия вируса гепатита В определяли слот-блот гибридизацией, Образцы сыворотки разводили в ЙН 40 Ас до конечной концентрации соли 1 М. Используя 72-ячеечный аппарат для микрофильтрации (ЗсЫесерег апб Ясное 1, Кеепе, й, Н.), образцы наносили прямо на нитроцеллюлоэный фильтр, который был предварительно эамочен в течение 10 мин в 1 М ИН 40 Ас. ДНК денатурировали щелочью 1 и згц и нейтрализовали. Разведения очищенной РНК ВНВ в нормальной человеческой сыворотке были проанализированы таким же образом для количественной оценки каждой слот-блот гибридизации. Фильтры отжигали, прегибридизовали, гибридизовали и отмывали в условиях высокой жесткости и акторадиографировали при стандартных условиях (Мап 1 а 11 з, Т., Ггтэсс, Е,Рапд ЗатпЬгооК , Мо 1 есо 1 аг Соп 1 пд: А 1 дЬогатогу Мэпоа 1, Соо Зргпд НэгЬОГ ОЬогатогу, Сой Ярг 1 пд НагЬог, 1982). Проба РНК ВГВ, использованная в гибридизации, была получена из рекомбинантной плазмиды, содержащей одну копию единичной длины ДНК ВГВ (НВз АО серотип аба 2), клонированную по ЕсоР 1 сайту, Плазмиду расщепляли Усой 1 и ДНК ВГВ очищали в двух циклах препаративного электрофореза в агароэном геле и электроэлюции. Очищенную ДНК ВГВ метили Р-дЦТФ до удельной активности 1-2 х 10 имп./мин х мкг, ис 9пользуя способ мечения со случайным праймером (Ре 1 пЬегд, А.Рапб Чодезлеи, В. Апаус. В 1 осйетп, 132, 6-13, 1983), Уровень чувствительности, достигнутый при помощи этого анализа, равен 1 пг ДНК ВГВ, На этом уровне чувствительности детектируется 2,9 х 10 молекул ЖНК ВГВ.Полученные радиоавтографы были оценены по степени относительной интенсивности, численно ранжированы согласно наблюденной интенсивности и описаны в табл. 5. Дни терапии даны в скобках.Благодаря предлагаемому способу мож. но ставить клинический диагноз нехватки дтРНК, не основываясь на обширных лабораторных данных, Может также существовать много менее очевидных состояний нехватки дтРНК. Например, посколькуЕй действует как (обратимый - ) ингибитор пролиферативных путем (Аоо и др., Се 1, мо.43, рр. 793, 1985) и поскольку дт РН К-зависимые медиаторы принадлежат к этим путям, клетки, проводящие дифференцировку с опухолегенным/метастаэным потенциалом, могут быть дтРНК-дефицинтыми,Из указанных примеров ясно, что по связанной биологической функции (напри 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 мер, клеточный ответ на экзогенный РАЙ), или биохимической функции (например, повышенная 2-5 А синтетаза), или по присутствию интермедиатов 2-5 олигоаденилатного пути легко диагностировать состояния нехватки дтРНК и определять степень деградации различными способами, включая а), Определение концентраций эндогенного 2-5 олигоаденилата;б), Количественный анализ концентрации 2-5 А молекулярного размера 2-5 А из образцов пациентов посредством жидкостной хроматографии высокого давления;в). Проверка биологической функциональности 2-5 А синтетаз у пациентов, используя анализ с расщеплением ри босом ной Р Н К,г. Анализ связывания с 2, 5- РзА( Р)3 рСр для определения уровня свободн.й (несвязанной) РНКазы в образцах пациентов;д). Кор-целлюлозный анализ (аффинная хроматография) с поли(ОнзР)рСр для характеристики специфичности активации РНКазы 2 - О А, синтезированной в образцах пациента;е). Анализ с расщеплением рибосомальной РНК для определения уровня активации РНКазы 2-5 А, синтезированной в образцах пациентов;ж), Анализ с расщеплением рибосомной РНК для определения уровня активированной РНКазы в образцах пациентов.Некоторые из этих способов детально описаны в патентном описании, озаглавленном "Вырабатывание метиаторов хозяйской защиты в биологические жидкости". серийный М 029, 823, зарегистрированном 12 августа 1987 г. и "Исправление двутяжевой РНК аберрантных метаболических путей", серийный М 074,649, зарегистрированном 17 июля 1987.Могут существовать также состояния достатка дтРНК, например СМ и лейкемия (волосатых - ) клеток (ЛВ К) часто способны к ответу на 1 Ю, который дается в виде единственной терапии и отражают внутриклеточные ситуации природного достатка дтРНК. Для подтверждения этого замечания, обн аружены сходные уровни 2-5 А синтетаза - активирующей дтРНК в ядрах одноядерных кровяных клеток от необработанных пациентов и в ядрах обработанных РАЙ клеток Не 1 а.Ложноспаренная дтРНК, В то время как многие дтРНК могут индуцировать лимфокины, включая 1 Рй, и активировать 2-5 А синтетазу, не все дтРНК обладают этими свойствами. Из синтетических дтРНК поли (1): поли (С) наилучший индуктор АЙ и активатор 2-5 А синтетазы, но Он также очень токсичен. Поли (1): поли (С 12, 0), также обозначаемая ложноспаренной ртРНК или Авр 11 деп В (НЕМ йезеагсЬ, 1 йс, ВосЫ 11 е, Магу 1 апб, ОЯА), содержит периодические остатки урацила в полипиримидиновой цепи. Ложное спаривание вызывает быстрый распад беэ нарушения биологической функции. Например, поли: поли (С 21, 0) проявляет антивирусную, антиопухолевую и повышающую иммунитет активность и не токсична.дтРНК используется в качестве заместительной терапии в терапии широкого спектра вирусов и рака. Ложйоспаренная дтРНК может быть, в частности, очень удобна при хронических вирусных инфекциях, включая обработку ССК, поскольку она и антивирусный агент широкого спектра, и усилитель мммунности, даже в высоких дозах она в сущности свободна от токсичности продолжительного действия. Данные на 45 последовательных пациентах, обработанных внутривенно 200-250 мг поли (1) - поли (С, 0) дважды в неделю, показывали быстрое снижение концентрации вируса (ВИЧ. СМ 1. и герпес) и долговременное усилие как Т, так и В-клеточной иммуности, сопровождающейся улучшенным выполнением, с отсутствием существенных побочных эффектов, У многих пациентов клинические ответы продолжались более приблизительно 18 месяцев или столь долго, сколь они продолжали терапии дтРН К (100-400 мг дважды в неделю). В некоторых случаях могут требоваться более часто применяемые большие дозы. Вирусные инфекции и иммунные нехватки у СПИД пациентов могут отличаться от одного индивидуума к другому, ни от одного агента нельзя ожидаться исправления всех возможных клинических проблем, Однако дтРНК может играть ведущую роль в различных режимах обработки. Например, поскольку дтРНК проявляет синергию с АЗТ в блокировании инфекции ВИЧ в Т 4 клетках (описание 4 028.823), ложноспаренная дтРНК и очень низкие дозы АЗТ могут быть важной комбинацией на ранних стадиях инфекции, включая ССК.Как дтРНК, так и 1-2 усиливают активность Т клеток, ПК клеток и ЫК клеток, отсюда в комбинации два агента демонстрировали терапевтический синергизм без добавочной токсичности. Поскольку 1 Гй усиливают дифференцировку В клеток и моноцитов, некоторые лимфокины могут усиливать способность дтРНК промо тировать специфические нейтрализующие антилела против ВИЧ и увеличить киллерную активность моноцитов. Сходным обра. зом, поскольку ретиноиды увеличивают число Т 4 клеток и промотируют дифференцировку как Т, так и В клеток 1 ГИ, комбинациядтРНК с ретиноидами может обеспечить до 5 полнительные преимущества при ССК иСПИД. Комбинация дтРНК с тимуснымипептидами может также иметь восстанавливающее действие на Т 4 клетки, особенно упациентов с очень низким числом Т 4 клеток,10 Тот факт, что ртРНК проявляет прямую антипролиферативную активность против клеток саркомы Капоши, которая может бытьусилена добавлением 1 Г 1 ч альфа или 11;2,предполагает новый противоопухолевый15 режим при данной болезни. Контроль параметров кровяных клеток при СПИД выявилувеличение проблемы с ЦНС. С этой стороны ложноспаренная дтРНК пересекает мышиный гематознцефалический барьер в20 количествах, достаточных для активации 25 А аденилатсинтетазы в клетках паренхимымозга, Следовательно, комбинация ртРНК сдругими агентами, включая лимфокины, которые пересекают гематоэнцефалический25 барьер, должна быть полезна при вируссвяэанных сумашествиях. Здесь лимфокинывключают интерфероны, предпочтительноинтерферон альфа, интерлейкины, в особенности интерлейкин(11-2) и рекомбинант 30 ный интерлейкин(г 11-2), и факторнекроза опухоли (ФНО), Такие включенылимфокин-активированные киллеры (ЛАК)образованные у животных в ответ на обработку лимфОкинОм.35 Когда в качестве лимфокина используется интерферон (альфа), обеспечиваетсяколичество от 0,01 до 100,000 ЯО на миллеелитр жидкости тела пациента. Когда лимфокин 11-2, предпочтительно г 1 1.-2,40 применяемое количество лежит в пределахот 10 ед. 11. - 2 на кг тела пациента до эначе 2ний, приближающимся к непереносимымуровням токсичности для пациента, которыемогут быть столь высоки к 10 ед, 1-2. Од 645 нако наиболее эффективные уровни с переносимыми токсическими реакциями лежат вдиапазоне от примерно 10 до примерно 10ед. 11-2 на кг веса тела,50 Обычно применяемые количества ложноспаренной ртРНК обеспечивают уровень от 0,1 до 1.000 мг ртРНК миллилитр жидкости тела пациента, Термин жидкость тела введен для ссылки на тот раствор сыворот ки, солей, витаминов и т,р., который циркулирует внутри организма и омывает ткани.Когда оба агентта (дтРНК и лимфокин) применяются, они могут быть применены в смеси, отдельно или одновременно, или последовательно,2001917 32 31 Внутриклеточная концентрация 2-5 А и активность 2-5 А синтетазы и РНКазы 1. Зп у 11 го в экстрактах ОКПК инфицированных вирусом индивидуумовПрименение дтРНК и лимфокина в ком. бинации включает случаи, в которых оба агента применяются вместе в виде терапевтической смеси, а также процедуры, в которых эти два агента применяются раздельно, но одновременно.Фиг. 1 - это схема, иллюстрирующая типичную нехватку дтРНК, которая приводит к болезненности хозяина, и достаток дтРНК, который приводит к выздоровлению хозяина. Биоактивная дтРНК вырабатывается внутриклеточно или вводится некоторыми вирусами(например, ЕМС) и включает последовательность энзиматических событий, включая продукцию лимфокина и активацию медиаторов, которая приводит к антивирусному состоянию, дифференцировке иммунных клеток и выздоровлению хозяина. дтРНК, введенная различными вирусами (например, ВИЧ) или опухолевые клетки могут разрушать этот путь, действуя как ингибиторы, Физиологические события могут ограничивать образование дт Р Н К или вызывать образование аберрантной дтРНК. Также аномалии приводят к хроническим инфекциям и болезненности хозяина. При ВИЧ и других хронических вирусных инфекциях иммунное расстройство может также быть результатом ингибитора РН Казы 1. (показано как альтернативный путь), который истощается подачей экзогенной дтРНК с подходящей конфигурацией,На фиг, 2, а и б - индукция 2-5 А олигоаденилатсинтетазы ложноспаренной дтРНК в ОЯК от пациентов с СМ 1. Пациент с СМ 1. был обработан одним 1 ТИ в течение нескольких дней (фиг. 2, а), затем ложноспаренной дтРНК и 1 Гй (фиг, 2, б), До и в течение обработки активность синтетазы измеряли в очищенных на Всо 11 ОЯК.Фиг,З- это фотография пластин агарозного геля после электрофореза, демонстрирующая указанное число дорожек и полосы или зонц по длине каждой дорожки, Повышенная активность РНКазы 1, связанная с новым продуктом расщепления в ОЯК паци 5 10 15 20 25 30 35 40 45 ентов с СМ 1, иллюстрирована на этой пластине, Венгерские клетки 1.929, которые поставляют рРНК, но не РНКазу 1, депозированы на условиях Будапештской конвенции и Американский коллектор типов культур в качестве АТСС М СВ 1 9659, клетки 1.929 депозированы в качестве СС 1.1 и однроядерные клетки от пациентов с СМ 1. получали согласно КагМо и 1 цбМд и 311 чегеап и др затем измеряли РНКазу. из ОЯК,Это также фотография пластин электрофорега в полиакриламидном геле, демонстрирующая присутствие фактора, ингибирующего РНКазу), в экстрактах ОКПК пациента с ССК, как определено в анализе с расщеплением рРНК. Экстракты клеток 1929, которые служат источником и РНКазы 1 рРНК, и ОЯК были приготовлены по Кагйо и 1 иба 19 и Рчегаап и др, соответственно. Дорожка 1:18 мкл экстракта клеток 1929(150 мкг тотального белка) инкубировали в присутствии 4 мкл ЯРО буфера, использованного для лизиса ОЯК плюс 5,5 мкл воды.Дорожка 2, идентична дорожке 1 за тем исключением, что вместо воды в инкубацию было добавлено 5,5 мкл истинной РэАз, 5 х х 10 М.Дорожка 3: идентична дорожке 1 за тем исключением, что до инкубации было добавлено 5,5 мкл ТХУ-растворимого экстракта (100 мкг тотального белка) из ОЯК от пациента с ССК.Дорожка 4: 18 мкл экстракта клеток .929 инкубировали с 4 мкл экстракта ОЯК от пациента с ССК (100 мкг тотального белка) и 5,5 мкл воды,Дорожка 5: 18 мкл экстракта клеток 1.929 инкубировали с 4 мкл экстракта ОЯК от здорового индивида (100 мкл тотального белка) и 5,5 мкл воды. Обозначены 283 и 165 рРНК, а также нормальные уровни продуктов специфического расщепления 2-5 А активированной РН Казы 134 2001911 33 Продолжение табл. 1 анализе со.связывани иоактивности елено в20;нием рРкого про али в ви3; 64-85 П ри ме ч а н и е, нмоль АТФ, вкл с поли /1/: поли /С/-агарозой, стандар нмоль/г белка, как определено в ное отклонение 20; расп./мин 50 мг белка, как опред повторности), стандартное отклонениеопределено в анализе с расщепле Количество образующегося специфичес тометрируя фотографии гелей, и выраж 288 рРНК х 100; - , 0; +, 10-30; , 31-6юченной в 2-5 А/мг белка, как определено в анализенов отклонение 9, НО не определено;нализе с кор-целлюлозой (в повторности), стандартНК(колонки 6 и 7) в двух независимых опытах.дукта расщепления (СПР) определяли, денсиде соотношения образующегося СПР к 183 и ; , 86-100.2001917 35 36 Таблица 2 Влияние цтРНК на образование инфекционных центров клеткамиСС 25, инфицированными распираторным синцитиальным вирусом Таблица 3 П ри меча н ие.Данные не использованы для подсчета средних количеств,Наивысшая концентрация ложноспаренной дтРНК(25 мкг/мл) былане токсична для клеток СС 25.Счетверенные ячейки сливающихся клеток СС 25 в 24-ячеечнойплате были заново снабжены 1,5 мл поддерживающей среды, содержащей дтРНК в обозначенной концентрации за 1 ч до рассеваклеток, инифицированных РСВ. Контрольно обработанные клеткиснабжались свободной от дтРНК средой,6 4 х 10 клеток СС 25 в суспензии инфицировали в общем объеме41 мл, содержащем 5 х 10 БОЕ РСВ (МО 1 12), Адсорбция вирусапроисходила в течение 2-часовой инкубации при 37 С с прерывистым ресуспендированием клеток. 8 конце этого периода суспензиюразводили 1/100 поддерживающей средой, 0,5 мл аликвоты инфицированных клеток добавляли непосредственно в каждую экспериментальную ячейку и в каждую ячейку контроля инфекционныхцентров, В каждую ячейку контроля клеток добавляли 0,5 мл поддерживающей среды. Все культуры инкубировали при 37 С в 5 ф СО 2957 ь воздуха в течение 72 ч, фиксировали метанолом и окрашивалипо Гимза. Бляшки (инфекционные центры) подсчитывали под микроскопом,38 2001917 37 Таблица 4 Активность 2-5 А и РНКазы , выделенных иэ ОКПК людей на гомополи- рибонуклеотидах Среднее из трех независимых определений; стандартное отклние 20.Та ица 5 Дейст менения дтРНК на уменьшения концентрации ДНК ВГВ (вируса гепатита жидкости тела П р и м е ч а н и е. Т- ноль (перед терапией).+ относится к относится к относительной интенсивности рентгеновской пленки, экспонированной втечение пяти дней и содержащей Р вирусной ДНК. Больше плюсов(например, 3+ по сравнению с 1+) относится к более интенсивным и большим слот-блотам на рентгеновской пленке, показывающим присутствие большего количества вирусной ДНК. Для увеличения чувствительности измерения вируса использовали различные разведения сыворотки пациента, обычны равзедения 1:40, 1:200, 1:40 и 1:1500. Завершающие результаты были основаны на денситометрировании слот-блотов. Методология была основана на реагентах, обеспеченных ЗсЫесерег апб Зспце (материалы обдоэначены М 370 2/284), Сочетающиеся результаты были получены при анализе специфического вирусного антигена (иммуноаналиэ на определение поверхностного антигена гепатита В в сыворотке или плазме), набор доступен от Аььои .аьогатог 3 еэ (обозначен технически 83-0804/В 12, датирован июлем 1985), 2001917Изобретение относится к постановке диагноза состояния нехватки дтРНК и процедурам подачи экзогенной дтРНК в подходящей молекулярной конфигурации для восстановления ее нормального уровня.Новые способы постановки диагноза и терапии вирусных болезней, хронических патогенных инфекций в общем и рака появляются, когда раскрыты разнообразные роли, которые играет дтРНК в хозяйской защите. Например, развитие СПИДа (ретровируснвя инфекция, рак) связано с постепенно ужесточающейся дисфункцией биологических процессов, которые каталиэируются дтРН К, включая не только биосинтез интерферона, но также продукцию биоактивного 2 - 5 А, активность РНКазы и различные опосредованные клеткой иммунные функции. Специфическое снижение количества биоактивной дтРНК или ферментов, которые зависят от дтРНК, внутри специфических клеток вносит вклад в прогрессию болезни. Состояние нехватки в путях, вовлекающих биоактивную дт Р НК, также леэкит в корне различных клеточных повреждений в хозяйских системах защити, привходящих к смерти. Ранее был обнаружен ингибитор РНКазы в лимфоцитах инфицированных ВИЧ пациентов, больных ССК и СПЛД, который является только одним результатом из многих неадекватных внутриклеточных уровней дтРНК. Терапия при помощи имеющей подходящую конфигурацию синтетической дтРНК устраняет один или н сколько этих ингибиторов, что может частично обьяснить клинический ответ, который наблюдается при уменьшении концентрации вируса и восстановлении иммунной функции с разными хроническими виремиями, которые в настоящее время продолжают в значительной степени противостоять решительному медицинскому вмешательству. Предлагаемый способ может обълпл 1 ть, определить и корректировать ряд состояний нехватки дтРНК при различных болезнях. Некоторые дтРНК, т,н, ложноспаренные дтРНК, могут фактически замещать дтРНК природного происхождения, что помагает поддерживать функции, необходимые для нормальных клеточных процессов. Отсутствие такоей регуляции отРНК, не будучи скорректированно подходящей зкзогенной дтРНК, может вызвать развитие аномальных клеточных процессов. Аномальнь.е клеточные процессы затем пркаодят к хроническим инфекциям вирусов или других внутриклеточных патогеное, сниженным функциям иммунных клеток. в конце концов к хронической болезненности и к собственно смерти.Клинические стратегии, Вирусные инфекции могут часто следовать за частичным нарушением иммунной системы такими разными агентами, как стресс и вирусы, которые атакуют непосредственно иммунную функцию. Например, СПИД следует за прогрессивным ухудшением в иммунной систе ме, вызванныМ инфекцией Т-лимфонитоввирусом иммунного дефицита человека - ВИЧ (СоШп е 1 а 1, Яс 1 епсе чо 1. 232, р,697, 1986).фСуществуют Разные обозначения виру сз ВИЧ: 1.Ач - обозначение вируса СПИД,выделенного в Пастеровском институте, Па риж, франция; НТ 1 чИ - обозначение виру.са СПИД, выделенного в Национальном институте здоровья, Бетеэда, Мэриленд, 20 США. Зджесь ВИЧ использован в качествеобщего названия вируса. Часть в тексте бу.дут ссылки на ВИЧ в общем виде или ВИЧ, или НТ 1 чИ 1, или МЧ беэ попыток дифференцировать их. Более того, термин ВИЧ 25 включает все другие. вирусы, которые могутбыть связаны с образованием СПИД, изолированы они уже или нет.Инфекция В ИЧ - это прогрессирующаяболезнь, хотя темп перехода от одной фазы З 0 к другой варьирует. У асимптоматическихиндивидуумов, инфицированных ВИЧ, мо.жет развиваться состояние (1.АЯ или пре- АЯС), характеризованное как лимфоаденопатия, Пациенты прогрессиру ют к СПИД связанному комплексу или ССК,демонстрируя дефицит Т 4 клеток и позднее сн,женную способность лимфоцитов подвергатьсяя антиген-стимулируемой пролиферации и продуцировать 1 Ей-гамма. Эти 40 пациенты теряют иммунные функции, опосредованные различными клетками, например задержанная кожная гиперчувствительность, со бременем становящаяся совершенно вялой, Они демонст рируют свидетельства поломки в защитномхозяйском механизме, включая инфекции герпесного опоясывающего лишая, ораль- ного кандидоза и такие симптомы, как продолжите 1 ьные лихорадки, ночные паты, 50 поносы и потеря веса. В конечном счете этипациенты испытывают определенные сильные условно-патогенные инфекции (например, пневмония, вызываемая Рпецгпос - узбз - саг 1 п 11) и затем их определяют как 55 имеющих полностью развитый СПИД с приблизительно 50;6 смертностью в течение 12 месяцев, Инфекция вирусом ВИЧ выбрана в качестве иллюстративного примера, потому что уровень нехватки дтРНК столь выражен.многие другие болезни, включая вялотеку2001917 ФОмм биологической жидкости.Формула изобрм ла изобретения2. Способ по п,1, отличающиися тем,СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ПАТОЛОГИЧЕ- что ложноспаренная дт РНК представляет СКИХ СОСТОЯНИЙ, СОПРОВОЖДАЮ- собой комплекс полиинозината и толици- щИХСЯ НЕХВАТКОЙ ОТ РНК, включаю- тидилата, содержащего от 1 на 5 до 1 на 30 щий введение в организм человека тера- уроциловых или гуанидиновых оснований,5певтического агента, отличающийся тем, 3. Способ по п.1, отличающийся тем. что в качестве терапевтического аента ис- что ложноспаренная от РНК содержит райпользуют ложноспаренную 91 РНК. кото оны разрыва связей и соответствует форрую вводят в количестве 1 - 1000 мкг на " 10 муле г 1 л гС 11-14) и.быздоройленце козяонааквойасщь(йщиреренццрю 3 ка оммунныз клетоканворусное сООт ояниеаклаЫция ВпРНК-забосоиого путоаоразоданое лци(рокона5 ооактобноя дщРНКнеадекоощньа уроВень ат РНК, иогущ приотсрВоВоаь цнгоботры да Рнхопосредадонного пупиоорпоЮаюе а 5 еррантиаго ломрокона(кцспощно-лаоильныц ИРЮ оасалттйдщ РНК сноженное ооразоопнолимроконасниженныо медоптор е поВышенноя сонтещазас менее щункцоонольным конечным медоатв ром РНКозойЬ) снОЯРннОя акяОВносп 7 ь оммунньп клеток Болезненность хозяина2001917 го Месяцю обработки Составитель Г, СмирноваРедактор Т. Пилипенко Техред М. Моргентал Корректор М. Ткач Заказ 3154 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 3щие вирусные инфекции, ассоциированы с похожими нехватками,Существенно, что типичная прогрессия, выведенная выше, не описывает существенных различий в клинической симптоматологии между ВИЧ-инфицированными пациентами или многими другими пациентами с хроническими болезнями, такими как инфекция Эпштейн-Барр или ЭБ, инфекция вирусом гепатита, цитомегаловирусом, герпесные инфекции и т.п, Компоненты иммунной системы распадаются с крайне различной скоростью у разных пациентов, потеря биоактивной 9 тРНК - это причина или фактор, влияющий на данный процесс. Инфекция ВИЧ может развиваться в различных типах клеток (например, в кровяных клетках, глиальных клетках), У некоторых пациентов в качестве первого симптома развивается нейрологическая дисфункция. Следовательно, различные индивидуумы могут иметь крайне различные терапевтические потребности, даже если все нуждаются в уничтожении ВИЧ в Т 4 клетках.У многих вирусных инфекций, включая такие у пациентов с ССК, могут быть выделены две общие патологические черты, набор иммунных нехваток и длящаяся вирусная инфекция (,:аос 1, Ргос, Иа 1. Асад. Зс 1. ОЯА, чо 1. 83, р.9278, 1986), Терапевтическое вмешательство, влияющее лишь на иммунные нехватки, но неудачное в борьбе с репликацией вируса. оказывает обратное действие, в особенности когда такая обработка активирует Т 4 клетки, Например, Т- хелперные клетки с рецепторами Тас способы к ответу на лимфокин 1. - 2, У жертв СПИДа 1 - 2 вызывает распространение ВИЧ-чувствительных клеток и очевидное ухудшение в болезни,Воздействие непосредственно на вирусные инфекции, например инфекцию ВИЧ, бывает успешным, в особенности ингибитором вирусной обратной транскриптазы, обозначенным азотимидином (АЗТ), который может уменьшить "нагрузку" ВИЧ у некоторых пациентов и продлить жизнь, Такая терапия не свободна от нежелательных результатов, У меньшинства пациентов АЗТ также вызывает временное восстановление иммуности, опосредованной Т 4 клетками, судя по измерениям временного роста Т 4 клеток и по появлению гиперчувствительности замедленного типа (ЕзсЫ ет а 1, чеа Епд). Мед., Лоу, 1987). Однако ингибиторы обратной транскриптазы токсичны в дозах, необходимых для получения значимого антивирусного эффекта, и поэтому плохо переносятся при длительном применении. Применение антивирусных агентовпредотвращения и обработки вируса, но мо гут иметь существенные ограничения: например, ВИЧ как и вирус гриппа) легко 40 45 50 55 5 10 15 20 25 30 может быть необходимо для жизни пзциента. 1 ЕМ (интерферон) неэффективен и как антивирусное вещество общего действия, и как анти-СПИДовое лекарство, возможно, потому, что он не является противоядием для 9 тРНК-связанных дефектов, Конечно, жертвы ССК/СПИДа имеют различные дефекты в путиЕЙ, такие как и родуцирование дефективного, кислотолабильного 1 ЕН и неспособность Т 4 клеток вырабатывать подходящие количества 1 Еч-гамма, которые хорошо описаны в медицинской литературе. Эти различные 1 ЕИ-связанные дефекты у пациентов с СПИД и ССК могут быть частично или всецело связаны с потерей активности РНКазы в лимфоцитах.ХОтя в лимфоцитах крови индивидуумов с ССК/СПИД и с другими хроническими виремиями увеличено количество 9 тРНК-зависимой 2-5 А синтетазы, те же клетки крови демонстрируют уменьшение количества аутентичной 2-5 А и низкое количество Р Н Каза. Низкую активность РН Казы сопоставляют с небольшими количествами белка с М 80.000, способного связывать фотоаффинно меченые аналоги 2 - 5 А. Это согласуется с путем цтРНК, который был блокирован и относительно отсутствует, и/или с ингибитором РНКазы.,Вакцинация против ВИЧ и других вирусов и использование пассивных антител анти-ВИЧ также обсуждаются для может инфицировать клетки скрытно. 9 тРНК игранет роль в усилении выработки антител против вирусов вообще и ретро- вирусов в частности. Двутяжевые РНК,дтРНК, составляют первую группу молекул.которые эффективны против как вирусных,так и иммунных повреждений при различных подострых/хронических вирусных ин" фекцияк, как ВИЧ и другие. Эти дефекты могут быть исправлены с лазерной точностью без неблагоприятного повреждения основных функций тела, что является общим ограничением доступных сейчас терапий хронических вирусных инфекций. Пациенты с неразрешившимися и вялотекущими вирусными инфекциями части имеют специфические дефекты в жизненных внутриклеточных 9 тРНК-зависимых путях,которые могут быть обращены или хотя бы частично исправлены экзогенно поданной 9 тРНК (это объясняется графически на фиг.1), и мониторинг этих путей перед и в течение обработки дает новый способ измерения степени терапии замещением 9 тРНК, 20019175 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 требуемой для индивидуального пациента или специфической основы болезни,Критические ферменты, связанные с хозяйской защитой, требуют 9 тРНК для проявления биоактивности. Эти ферменты могут быть активированы экэогенной 9 ТРНК, если уровень внутриклеточной природной 9 ТРНК столь низок. Часть плейотропного воздействия дтРНК происходит иэ ее способности индуцировать синтез всего спектраЕй-альфа, бета и гамма, которая действует через группу внутриклеточных медиаторов, включая цтРНК-зависимую протеинкиназу, 9 ТРНК-зависимую 2 - 5 А синтетазу и 2 - 5 А зависимую РНКазу 1 . Эти 9 тРНК-зависимые ферменты могут выполнять многие биологические активности, относимые к 1 ЕЙ, как описано 1 епцуе (Апп. Йеч. В 1 ОСЬев, чо 51, р.251, 1982). Например, образование анти- смысловой РНК, которая блокирует экспрессию 2 - 5 А синтетазы, вызывает абсолютную чувствительность животных клеток к инфекциям разными вирусами (ВепбеЫ е 1 а 1, Ргас. Йат, Асаг 1. ЯС 1 ОЯа, чо 1,84, р,658, 1987), 9 тРНК-активируемая протеинкиназа фосфорилирует е Е 2, что ингибирует белковый синтез, она также обладает протеолитической активностью для расщепления вирусных белков. 9 тРНК-активируемая 2-5 А синтеза синтезирует 2 - 5 А, который играет критическую роль как в подавлении различных вирусов животных, так и для контроля роста клеток(уход от которого может привести к образованию опухоли).2-5-олигоадениловые кислоты необычны в том, что нормальная 3, 5 фосфодизфирная связь, характерная для большинства 9 ТРНК, замещена новой фосфодизфирной связьью с приобретением новых биологических СВОЙСТВ.Антивирусная активность 9 ТРНК. дтРНК - хорошо известный индуктор антивирусного состояния (Магсцэ е, а 1, Батоге, чо 1.66, р,815, 1977), Поли/А/; поли/У/ генерирует антивирусное состояние без индукции 1 ЕИ, Но существует природная регуляция 9 пРНК и, следовательно, действительные состояния нехватки 9 тРНК распространены у людей с патогенными случаями (вирусные, грибковые, протозойные, бактериальные инеазии и т дв особенности те, которые имеют внутриклетоцные у человека) присутствие в качестве желательного или обязательного компонента жизненного цикла).Антипролиферативная активность9 тРН К, Ранее обнаружено (3,1 ЕМ, Вуз чо 1, 6, р.373, 1986), что 42 из более чем 100 свежих человеческих опухолевых образцов при исследовании в полужидком агарв демонстрировали 50 или более уменьшенив образования колоний опухолевых клеток после лишь одной обработки 9 ТРНК, Эти клетки имеют нехватки 9 ТРНК. Известна независимая 1 ЕМТРНК-чувствительность у разных линий опухолевых клеток человека. Человеческие опухоли, размножаемые в безволосых мышах, были чувствительны к 9 ТРНК; терапия 9 ТРНК исцеляла от некоторых опухолей (например, почечной) и животные жили нормальной жизнью (см. Европейское патрнтное описание 0,113,162). В данном способе описана корреляция между клиническими ответами и активацией 9 ТРНК-зависимых ферментов в противоположность измеримой индукции 1 Е или И -2, вторичной по отношению к прим" ению 9 ТРНК,Усиливающая иммунитет активность 9 тРНК, Известно (1. 1 щеопо 1, ч.124, р.1852, 1980), что цтРНК повышает цитолитическую активность природных киллеров человека (ИК) по отношению к клеткам лейкемии человека. Требования к структуре 9 ТРНК для прироста К параллельны с таковыми, нужными для активации 2 - 5 А и индукции ЕИ. Контроль генов, опосредованный 9 ТРНК, ЯцИО еа 1 (СеИ, 43, р.798, 1985) продемонстрировали, что 9 тРН К индуцирует гб. ны компетентности в покоящихся фиброобластях, включая онкогены, обозначенные атос и тус. Здесь "гены компетентности - те гены клетки, действие которых требуется для модулирования жизненных действий, как мультипликация, рост и т.д. Индукция гена 1 ЕН-бета дтРНК может использовать регуляторный белок, который удаляется при обработке 9 ТРНК (21 пп еа 1, СеИ, ч,45, р,611, 1986), По биологической активности экэогенно поданные 9 ТРНК подобны такой природной невирусной внутриклеточной 9 тРНК, как гетерогенная ядерная РНК или комплексы мРНК с поли/У/. Например, 1 ЕМ - индуцибельная дтРНК в ядрах клеток Неа способна активировать 2-5 А синтетазу 1 п ч 1 тго. Возникновенив клеточной иммун ности в далеком прошлом Вволюцион ого цикла животных, очевидно, определило этап эволюции молекул 1 ЕМ/цтРНК в направлении обеспечения клеточной дифференцировки, в частности дифференцировки, запускаемой 1 ЕМ. Таким образом, 9 тРНК может обеспечивать дифференцировку, запускаемую другими регу. ляторными белками, который определяют этап определения состояний нехватки 9 тРНК.На фиг. 1 показана схема, иллюстриру- можным для пациента оценить степень зающая два пути; к болезненности хозяина и местительнойтерапиицтРНК,требующейся его выздоровлению; на фиг, 2,а - графиче- для индивидуального состояния. Остальные ская диаграмма: число дней до и после на- значения определения нехваток цтРНК дачала терапии Е в обозначенном количестве 5 ны ниже, "Медиаторы" определяются по относительно активности синтетазы, на фиг, способу действия как любые внутриклеточ, б - график, сравнивающий количество ныечастицы, напримерспецифическиеолибелыхкровяныхтелеци количестволожнос- гонуклеотиды, белки, цтРНК сами по себе паренной цтРНК после 120 дней обработки; или в комбинации, которые проявляют спена фиг, 3 - фотография электрофореза в 10 цифические биохимические функции, иниполиакриламидном геле (в пластине), де- циируемые присутствием цтРНК. Такие монстрирующая различные зоны и полосы биохимические функции вносят вкладвусина протяжении каждой дорожки; на фиг, 4 - лие механизма хозяйской защиты на уровне график, сравнивающий абсолютное количе- как единственной клетки, так и всего оргаство Т 4 лимфоцитов на кубический милли низма.метр крови, выраженный в процентном Условия, подходящие для терапевтичеизменении от нулевой линии с месяцами ских процедур, в общем те, при которых терапии. нехватка цтРНК больше нормальных предДвутяжевые РНК (цтРНК) составляют елов по сравнению со здоровыми инидивипервую группу молекул, которые эффектив дуумами, нехватка цтРНК вызывает ны как против вирусных, так и против им- патологии тканей и/или в присутствии немунных повреждений различными нормально низкого уровня цтРНК, сочетаю- подострыми/хроническими вирусными ин- щегося или сосуществующего с фекциями, как ВИЧ и другие. Эти дефекты присутствием внутриклеточного патогена, могут быть исправлены с лазерной точно Более частные условия или патологии ткастью без нежелательного повреждения ос- ней и конституциональные симптомы вклютальных функций тела. что является общим чают такие вирусные инфекции, как ограничением для доступных в настоящее ретровирусные, включая ВИЧ, семейство время терапий хронических вирусных ин- вирусов герпеса, парамиксовирусы, риновифекций. Пациенты с неразрешенными и вя рус, гепатит и синдром хронический усталоруемую лотекущими вирусными инфекциями часто сти, Прочие включают неконтролир ем ю имеют специфические дефекты в жизнен- пролиферацию раковых клеток и патологии ных цтРНК-зависимых путях, которые могут иммунной системы, находится компонент- быть исправлены или улучшены по крайней ная клетка в процессе мультипликации или мере частично экзогенно поданной цтРНК 35 дифференциации или нет.(это обьясняется графически на Фиг 1),мо- Под ложноспаренной цтРНК понимаютниторинг этих путем до и в течение обработ- ся те, у которых водородные связи (стэкинг ки обеспечивает новый эффективный оснований) между цепями относительно инспособ оценки степени заместительной тЕ- тактны, т,е. прерываются в общем менее рапии цтРНК, требуемой индивидуальным 40 чем один раз на каждые 29 последователь- пациентом или специфическим состоянием ных остатков оснований, Ложное спариваболезни, ние - это разрыв в нормальной геометрииЭтотспособобеспечиваетдиагностиче- двойной спирали РНК пугем втягивания скую процедурудля определения состояния (или выпячивания) цепей, который преднехваткицтРНКу пациента, количественно ставляет собой точку подверженности го определения этой нехватки(при наличии) цтРНК расщеплению рибонуклеазами.и обеспечение терапевтической процедуры цтРИК может быть комплексом полидля восполнения любой определенной не- инозината или полицитидилата, содержа- хватки тРНК. Пц . рименением экзогенной щим часть урациловых оснований или цтРНК возможно с лимфокином. Обычно со гуанидиновых оснований, например, от 1;5 стояние нехватки цтРНК заметно внутри до 1:30 (поли 1 - поли/С 4-2 охО или С).клетки - компонента иммунной системы, на- цтРН К может иметь общую формулу гЬх ходится клетка-компонент в процессе муль- хг(С 12 Цп, Другие примеры цтРНК приведетипликации или дифференциации или нет. ны ниже.Нехватка цтРНК заметна, например, по не В предпочтительной ложноспаренной способности клетки - компонента иммун- цтРНК, г 1 г(Сц О)п, район, состоящий из ной системы поддерживать существующий неразрывной последовательности 6 - 12 пар уровень биоактивной РНКазы. Мониторинг основан й, т,е. от половний, т,е. от половины до одного полвнутриклеточных цтРНК-зависимых путей ного витка спирали РНК, служит и как биодо, в течение и после терапии делает воз- триггер. вызывабр. вызывающии освобождение10 20 25 30 35 40 50 55 лимфокинов, и как облигатный внутриклеточный кофактор для ферментов, представляющих природные антивирусные пути. Ложноспаренные районы, состоящие из остатков урацила, периодически инсертированы в полипиримидоеую цепь для ускорения гидролизэ РНК и предотвращения токсичности.Ложноспаренная дтРНК, предпочтительная для использования в настоящем изобретении, основана на кополинуклеотидах, выбранных из поли(С. 6), где и - фактор имеет значения от 4 до 29, и явля ющихся аналогами (ложноспаренными) комплексов полирибоинозиновой и полирибоцитидиловой кислот, образованными модификацией г 1 л гСл для введения неспаренных оснований (урацила или гуанидина) в полирибоцитидилатную (гСЛ) цепь, Альтернативно дтРНК может быть получена из цтРНК поли/1/-поли/С/ модификацией рибозильного скелета полирибоинозиновой кислоты (г 1,), например включением 2-0-метилрибоэильных остатков, Эти ложноспаренные аналоги г 1 л гСп, предпочтительные из которых имеют общую формулу г 1 пг(С 11-ц, О)п и г 1 л г(С 29, 6)л, описаны Сапег и Тзо в патентах США М 4130641 и 4024222, дтРНК, описанные в них, удобны для использования в предлагаемом способе. В некоторых случаях комплементарные олигонуклеотидные дуплексы (спирали) также достаточны в качестве заместительной терапии.Другие примеры ложноспаренной дтРНК для использования е способе включаютполи/1/.Поли/С, О/поли/1/,поли/С 7, О/поли/1/.Поли/С 1 з, О/поли/1/.поли/С 22, О/поли/1/,поли/С 20, 6/поли/1/,поли/С 29, 6/поли/1/.поли/Ср/23 6рСинергия цтРНК-лимфокин. Поскольку цтРИК оказывает существенную часть своего биологического действия через специфическую систему лим фоки нов, опосредованную частично ГМ, она должна (а) индуцироватьГМ в 1 ГМ-дефицитных клетках, (б) активировать уместные дтРНК- зависимые ферменты-посредники, причем клеточная цтРНК неиндуцибельна в клетках и нв отвечает на зкзогенно примененный 1 Г 1 ч,Если цтРНК действует только через систему ГАВ и цтРНК находится в клетках в избытке, тогда избыток одногоГЙ оказывает такое же биологическое действие. как и комбинация 1 ГМ и дтРНК. Однако это должно быть относительно редким состоянием,поскольку имеется много примеров цтРНК 1 Г 1 ч-синергии и мало примеров отсутствия синергии. Например, дтРНК синергичнэ с человеческими ГАВ-альфа, -бета или -гамма в ингибироеании роста клеток иэ человеской карциномц пузыря, карциномы легких и фибросаркомы, Можно расширить эти результаты на 15 других линиях опухолевых клеток человека, причем только одна из них не показана антипролиферативной синергии, Сходный синергизм был заметен нэ некоторых опухолях человека, привитых нэ безволосых мышах; клинически наблюдают, что комбинация 1 Ю и дтРНК была лучше,чем каждый из агентов в отдельности, в качестве протиеоракового режима по отношению как к опухолям почки, так и к СМ 1Состояние нехватки дтРНК, Как протО- типный путь, путь 2 - 5 А синтетаэц (РНКагы) включает одну или более дтРНК, 2-5 А, связанные ферменты и ингибиторы. Существует прямая биохимическая связь между дтРНК и РНКазой в том, что 2-5 А, продукт.,тРНК-зависимой 2-5 А синтетазы является необходимым кофактором для активности РНКаэы., Примеры предназначены служить примером нескольких из многих возможных видов дефектов в дтРНК-опосредованных путях, которые могут быть исправлены экзо. генно поданной цтРНК.Схема на фиг. 1 иллюстрирует связи между достатком цтРНК, приводящим к выздоровлению хозяина, и нехваткой цтРНК, приводящей к болезненности хозяина. Биоактивная цт РН К вы рабатывается внутриклеточно или вводится при некоторых событиях, которые приводят к антивирусному состоянию так же, как и к дифференцировке иммунных клеток и выздоровлению хозяина,Измерение 2-5 а синтетазы 1 п ч 1 го имеет ограниченную ценность, поскольку не отрэжает активности 2 - 5 А синтетазы 1 п ччо. Отсюда разработан способ экстракции и количественного определения 2-5 А из одно. ядерных клеток периферической крови (ОКПК) здоровых индивидуумов и инфицированных патогеном пациентов до и после терапии ложноспаренной цтРНК. Концентрация 2- А может быть определена по способности 2-5 А активироеать эффинно очищенную РНКазу. и деградации поли/О// 2 Р/рСр,Методы. Гепаринизированную и периферьйескую кровь получали от десяти здоровых индивидуумов и от пяти пациентов-мужских гомосексуалистов с 1 АЗ, ССК и СПИД, как определено Центрами по борьбе с болезнями, С клинической точки зрения проводиливирологические и иммунологические характеристики пациентов, вовлеченных в это исследование (пациенты 1-5) были охарактеризованы ранее как пациенты 10, 8, 1, 7 и 2 соответственно со статьей тапсе, 5 Залпе 6, 1987. ОКПК изолировали на Гсо - Нурацуе, Клетки929 и Н 1 929 (РНКаза-дефицитный субклон929) поддерживали в монослоной культуре. Цитоплазматические экстракты иэ клеток929 и Н 929 получали 10 в грицериновом буфете, экстракты из ОКПК получали в МР 40-лизисном буфете, Концентрация белка в экстрактах составляла 10 - 15 мгк/мкл, СК, саркома Капощи; ППК, пневмония 15Рпецлосуыс сагп ПАктивность 2-5 А синтетазы (колонка 3) определяли в экстрактах ОКПК (50 мкг белка/анализа), используя поли/С 1/:поли/С/- агарозу, 2-5 А выделяли из этанолрастворимой фракци экстрактов ОКПК (100 мгк белка, 700 ь этанол, об/об), э:",трагирова ную этанолом затем лиофилизировали и растворяли в воде (20 мкл).Концентрации внутриклеточной 2-5 А, при сутствующей в экстрактах ОКПК (колонка 4), определяли в анализах в кор-целлюлозой с экстрактами клеток929 в качестве источника РНКазы по калибровочным кривым, полученным с истинной 2-5 А Активация 30 РНКазы 2-5 А в этом анализе основана на превращении поли/О// Р/рСр в кислото 32растворимые фрагменты, В контрольных опытах (в отсутствие 2 - 5 А) на фильтрах из стекловолокна задерживалось 6500 35 расп./мин иэ общего добавленного количества 17700 расп./мин поли/О// Р/рСр (1,3 мкКи/нмоль). В присутствии ( 1 х 10 М истинной 2 - 5 А поли/О//" Р/рСр деградировал на 0; в присутствии1 х 10 М 40 истинной 2 - 5 А поли/О// Р/рСр деградировал на 1000/, Уровни латентной РНКазы определяли двумя способами: (1) в анализах со связыванием радиоактивности после добавления 20000 расп/мин рзА 4/ /Р/рСр к 45 экстрактам О КП К/50 мкг белка/анализ/и (2) в анализах с расщеплением рибосомной РНК в присутствии 2-5 А (колонка 6). Экстракты, полученные из клеток 929 (150 мкг белка/анализ), инкубировали 60 мин при 50о30 С в присутствии 5 мкл этанолраствозоимой фракции экстрактов ОКПК и 1 х 10 М рзАз в конечном обьеме 20 мкл, Тотальную РНК экстрагировали, денатурировали и анализировали элекгрофореэом в 1,80/, агароз ном геле. Окрашенные бромистым этидием полосы визуализировали в УФ-свете, Активированные уровни РНКазы(колонка 6) определяли в анализах в расщеплением рибосомальной РНК в отсутствие добавленной 2 - 5 А,Концснтрация функциональной 2-5 А в экстрактах ОКПК варьировала от 0,3 до 1,1 нмоль/г белка у здоровых индивидуумов и от уровней, меньше определяемых до 0,6 нмоль/г белка в экстрактах ОКПК иэ инфицированных вирусом пациентов до обработки ложноспаренной дтРНК (табл. 10, колонка 4), Однако 2 - 5 А накапливается до более чем 10 н/моль/г белка по мере терапии ложноспаренной цтРНК, Ранее отмечалось, что 2-5 А активизированная частично очищенная РНКаза предпочтительно расщепляет поли/О/, но не поли/С/, Выделенная человеческая 2-5 А(как и истинная 2 - 5 А) могла активировать аффинно очищенную РНКазу из либо клеток Е 929, либо ОКПК от здоровых людей к специфической деградации поли/О/, см. табл. 4. Важно отметить, что когда для экстракции 2 - 5 А из ОКПК используется ТХУ в дополнение в поли/О/-деградирующей активности (РНКазы) экстрагируется поли/С/-деградирующая активность. Эта поли/С/-деградирующая ТХУ-экстрагируемая активность может быть устранена протеаэным расщеплением или дальнейшей экстракцией этанолом. Поли/С/-деградирующая активность была обнаружена в ТХУ-растворимой фракции ОКПК от всех людей, но ни в одной иэ постоянных линий клеток (т.е. Неа .929, Н 929), проверенных на это, Поли/С/-деградирующая активность не была заметна ни в одной из этанолрастворимых фракций ОКПК.М 01 обозначает множественность инфекции. Это означает приблизительное количество вирусных частиц, приходящихся на каждую клетку-мишень.БОЕ обозначает бляшкообраэующие единицы, Это означает количество вирусных частиц, определенное подсчетом цитопатических (мертвых) клеток,Хотя осуществляли сообщения о присутствии 2-5 А в тканях, выделенных из необработанных животных, и о накапливании 2 - 5 А в тканях мышей, обработанных 9 тРНК, здесь сообщается о накапливании 2 - 5 А в ткани человека, Точно установлено, что истинная 2-5 А связывается РНКазой и активирует ее к деградации рРНК до высокохарактерных продуктов специфического расщепления (СПСР), Поэтому активность 2-5 А, выделенной из экстрактов ОКПК характеризуется в анализе с расщеплением рРНК, Специфический поттерн расщепления, создаваемый РНКазой с экстрагированной этанолом 2-5 А, тот же, что и полученный в присутствии истинной 2 - 5 А. Эти результаты показывают, что (внутривенБ 10 15 20 ное) применение ложноспаренной 9 тРНК к инфицированным вирусом пациентам вызывало резкое повышение 2-5 А в кровяных клетках от концентраций, которые были ниже определяемых.Активность РН Казы 1.Отсутствие активности РНКазы у индивидуумов, инфицированных ВИЧ, было подтверждено и данные расширены (табл. 10 колонки 5-7). Чувствительный метод, основанный на специфичности активированной 2-5 А РНКазы к расщеплению рРНК (ЮгеэсЬег ет а 1, Мосе 1 с Асдэ Йеэ, ч.9, пп.1571-1581, 1981), позволяли измерять активированную РНКазу в экстрактах из ОКПК, выделенных из всего лишь 1 мл периферийной крови. Экстракты РНКазы дефицитного субклона линии клеток 929 (Н(.929) были использованы в качестве источника рибосом. Экстракты ОКПК инфицированных ВИЧ пациентов имели в 5-7 раз более низкие уровни латентной РНКазы, чем экстракты здоровых индивидуумов, как определено в анализах со связыванием радиоактивности (табл. 1, колонка 5, 240-280 против 1350 расп/мин), Сходные наблюдения описаны ччц и др, (А%5 ВезегагсЬ, ч. 2, р.127-131, 1986). Применение анализа со связанной радиоактивностью ограничено в отношении определения уровня латентной РНКазы у пациентов, обработанных ложноспаренной 9 тРНК, поскольку в образцах ОКПК от этих пациентов присутствует накопленная 2 - 5 А (табл. 1, колонка 4), которая может конкурировать за связывание с РНКаэой Поэтому определение уровня активированной 2 - 5 А РНКазы необходимо,Сначала уровни активированной РНКаэы. определяли. измеряя специфическое расщепление рРНК экстрактом из ОКПК в отсутствии экзогенно добавленной 2-5 А (табл.1, колонка 7). Используя этот анализ, РНКаэа не была активирована в экстрактах ОКПК пациентов, инфицированных ВИЧ, до терапии (полиакриламидные гели, показанные на фиг. 3), Зная, что уровни внутоиклеточной 2-5 А в этих образцах ОУПК были низкими (табл, 2), эти результаты не были неожиданными. Однако экстракты их ОКПК от всех проверенных здоровых индивидуумов демонстрировали присутствие активированной РНКаэы 1, которая образовывала продукты специфического расщепления в анализах с расщеплением рРНК, хотч количество 2-5 А у некоторых здоровых индивидуумов было столь низко, как 0,3 нмоль/г белка (табл. 2), Существенно, что о; сутствие активности РН Казы в образцах от ВИЧ-инфицированных пациентов до терапии не могло быть благодаря накоплению конку 25 30 35 40 45 50 55 рентного ингибитора 2-5 А, как сообщалось в Сауе 1 е 1 а 1, Ецгореап,1. Восй., ч.143, р.165 - 177, 1984, активность РНКазы. не могла быть восстановлена добавлением истинной 2 - 5 А (табл. 1, колонка 6).Затем определяли уровни латентной РНКазы в двух независимых измерениях. Латентную активность РНКаэы. определяли в анализах специфическим расщеплением рРНК, но в присутствии добавленной 2-5 А (табл, 2). В образцах, взятых до терапии ложноспаренной дтРНК, ни у одного иэ пяти обследованных пациентов не была обнаружена латентная РНКаэа 1Способ Фотоаффинного мечения с РзА 4( Р)рСр был использован для дальнейшего определения отсутствия РНКаэа 1 в ОКПК БИЧ-инфицированных пациентов (илн она изменена). Предыдущие исследования с фатоаффинным мечением идентифицировали белок с Мг 80.000 с РзА 4( Р)рСр связывающей активностью и специфической поли/У/зндорибонуклеолитической активностью как РНКазу 1 Аффинное мечение РНКазы, присутствующей в экстрактах ОКПК, определяли, используя РЗА 4( Р)рСР. РНКазу из экстрактов ОКПК (50 мкг белка) от нормальных индивидуумом в сравнении с ССК-пациентом (пациентом до терапии ложноспаренной 9 тРНК) или экстрактом клеток 929 (50 мкг белка) фот 2 оэффинно метили после добавления РзА 4(з Р)рСр (30000 расп,/мин. 3000 Ко/ммоль) в отсутствии или в присутствии истинной РЗА 4 (1 х 1 О М). РНКазуЕ из экстрактов ОКПКот нормальных индивидуумов (100 мкг белка) очищали от 2-5 А кор-целлюлозе и фотометиле после добавления РзА 4( Р)рСР (30000 расп,/мин, 3000 Ко/ммоль), После 90 мин инкубации при 0 С образцы переносили на охлажденные во льду Фарфоровые капельные пластины и фотомуировали 3 мин, используя 254 нм ОЧС - 11 МпегаН 9 И лампу (Чгачо 1 ет Ргобисв) на расстоянии 2 см (1 3/м . Опре. деляли положение маркерных белков и РНКазы 3 с Мг 80000.Исследования с фотомечением выявили, что РзА 4( Р) рСр ковалентно пришивает 32ся к белку с Мг 80000 в экстрактах ОКПК от здоровых людей (данные полиакриламидного геля не приведены). Однако мечение белков отсутствовало в экстрактах ОКПК от хронически инфицированного вирусом пациента, При тех же экспериментальных условиях в экстрактах клеток 1.929 специфически фотометился белок с Мг 80000. Добавление РЗА 4 (1 х 10 М) к инкубационным смесям, содержащим РзА 4( Р)рСр предотвращало фотомечение,З 2т.е, обеспечивало дополнительное свиде 17 200191710 20 25 30 35 40 45 50 55 тельство, что фотомечение было высокоспецифично к РНКазе, Исследования с фотомечением белка, очищенного иэ экстактов ОКПК от здорового человека корцеллюлозным методом, выявило ковалентное связывание с белком с Мг 80000, который был способен деградировать поли/У/, но не поли/А/, поли/Ц/ и поли/Г/ в присутствии истинной 2 - 5 А (табл, 4). Сведенные вместе эти результаты доказывают, что белок очищен от ОКПК здоровых индивидуумов и мечен РзА 4( Р)рСр.После 4-17 недель терапии ложноспаренной дтРНК активированная РНКаза впервые определялась в экстрактах ОКПК от всех пяти хронически инфицированных пациентов; от 17 до 28 недель терапии ложноспаренной дтРНК активность активированной РНКазы для всех пяти пациентов была эквивалентна уровням РНКазы, наблюдавшимся у здоровых индивидуумов (табл. 1, колонка 7). Уровень активированной РНКазы показывал очень тесную корреляцию с концентрацией функциональной 2 - 5 А, выделенной из тех же образцов (табл, 1, в сравнении с колонками 4 и 7), Крайне интересно, что пациент 1 поддерживал повышенный внутриклеточный уровень 2 - 5 А и полностью активированную РНКаэу на 28 неделях 3 неделями позднее того, как терапия ложноспаренной . дтРНК была прервана (табл, 1, колонки 4 и 7).Описанные здесь эксперименты показывают, что пять ВИЧ-инфицированных пациентов имеют общий молекулярный фенотип в одноядерных кровяных клетках, сниженный уровень 2 - 5 А и отсутствие определяемой активности РНКазы . Одноядерные кровяные клетки здоровых людей проявляли фенотип, отличный в том. что уровни 2 - 5 были в среднем выше и активность РНКаэы была легко определяема.Последний фенотип больше сочетается с тем, что ожидается от функционального пути 2-5 А синтетазы (РНКазы). У нормальных индивидуумов неизменное состояние пула 2-5 А - измеримое; заметная часть этой внутриклеточной 2 - 5 А может стать тесно ассоциированной с РНКаэой, т.е, активируя РНКазу, В экспериментальных процедурах установлено, что в одноядерных кровяных клетках хронически инфицированных вирусом людей внутриклеточные уровни 2-5 А ниже детектируемых и отсутствует активируемая РНКаза., как определено доступными в настоящее время способами.Важное открытие здесь то, что дефекты в пути 2-5 А синтетаза/РНКаза были исправлены терапией ложноспаренной дтРНК,Результаты не объясняются простг нормальными уровнями белка РНКаэы без 2- 5 А, поскольку активность РНКазы и Итгс не была восстановлена добавлением 2-5 А к экстрактам ОКПК. Белок РНКазы 1 должен отсутствовать или быль ингибированным, Это подтверждается потерей связывания фотоаффино меченного аналога 2-5 А. У обработанных пациентов уровни РНК ВИЧ уменьшались в ОКПК эа 10 - 20 дней, количество инфекционных центров (кокультивация) падало более медленно, Увеличение внутриклеточной 2-5 А и активности РНКА- зы более близко соответствует уменьшению инфекционных центров у этих пациентов, Путь 2-5 А синтезы (РНКазы) становился у обработанных ВИЧ-инфицированных пациентов более активным, чем у здоровых людей, после нескольких недель терапии ложноспаренной дтРНК, таким образом, некоторые хронические вирусные инфекции представляют собой состояние нехватки дтРНК, которое может быть исправлено подачей экэогенного источника биоактивной дтРНК,П р и м е р 1. Координированная обработка ГИ и дтРНК.Состояние нехватки дтРНК таково, что в нем обработанные Гй опухолевые клетки демонстрируют небольшоеЮ-индуцированное прекращение роста или отсутствие такового, Это функциональный или операциональный тест на нехватку дтРНК, который может быть строго подтвержден, если необходимо, различными биохимическими измерениями, описанными ниже. Во многих случаях клинический диагноз нехватки дтРНК станет достаточным по мере того, как способ станет более широко практикуемым. Известно, что ГЙ-устойчивые опухолевые клетки редко дефицитны по рецепторам Гй и могут содержать высокие или низкие уровни медиоторов, но в каждом случае они отвечают на экзогенно поданную дтРНК, Эти примеры клинически значимы, поскольку они показывают, что дтРНК существенно расширяет терапевтическое значение ГЫ и также других лимфокинов, например- 2, различные факторы стимулирования колоний и ФНО, Хроническая миелогенная лейкемия (ХМЛ) - подходящий случай, Около б 0 пациентов с ХМЛ отвечают на один интерферон, в то время как 40% - нет, Последние не могут индуцировать 2 - 5 А синтетаэу в одноядерных кровяных клетках (ОКК), как описано ВозепЬигл Ь/Сапсег Вез,. ч,460 р,4848, 1986), На фиг. 2,а представлен ГМ- резистентный случай, который обработан ложноспаренной дтРНК плюс ГИ после короткого курса (7 дней) одного ГМ, затем