Способ получения вектора, имеющего нуклеотидную последовательность, кодирующую протеин

СОЮЗ СОВЕТСНИХшэюмпювсмииРЕСГ 1 УБЛИН 09 011 а) 4 С 12 Н 15/00 1ЖСР.13,ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Дзе Риджентс оф дзе Юниверсити оф Калифорния (118)(72) Вильям Дж. Раттер, Говард Майкл Гудман, Джон Митчелл Чергвин (118), Аксель Ульрих, Питер Хорст ЗеФбург (ВЕ), Джон Шайи (А 0) иРэймонд Луис Пиктет (СН) (53) 575.2:576. 8,57 ( 088,8)(56) Вподеоп Р е а 1. 1 пэегСюп оГ а гаЪЬ Ьейа е 1 оЬдп еепе эеоцепсе про оп Е. со 1 р 1 азппй - Ицс 1 едс асЫз Вез",1975, 2, 2365-2378. ., (54) (57) 1, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕКТОРА, ИИЕЮЦЕГО НУКЛЕОТИДНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, КОДИРУЮЩУЮ ПРОТЕИН, включающий выделение клеток животной ткани, экстракцию мРНК из клеток, кодирующей протеин в присутствии ингибитора РНК-аэы, выделение мРНК, последующий синтез комплемен-тарной ДНК и конструирование нуклеотидной последовательности, кодирующей протеин, о т л и ч а .ю щ и й - с я тем, что, с целью получения вектора, имеющего нуклеотидную последовательность, кодирующую гормон роста, в качестве клеточной ткани животного используют клетки гипофиза, в качестве ингибитора РНК-аэы используют раствор 4 М гуанидинэтиоцианата и 0,2 М бетамеркаптоэтанола, а вектор синтезируют путем реакции комплементарной ДНК с ДНК-молекулой, имеющей реакционнослособные концы, способные соединяться между собой или с комплементарной ДНК при условии предотвращения соединения реакционноспособныхконцов молекулы ДНК.2. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что для предотвращения соединения реакционноспособных концов молекулы ДНК, ее обрабатывают щелочной фосфатазой.которую используют для синтеза требуемого двунитевого ДНК-продукта,С целью идентификации однонитевуюкДНК анализируют для выяснения возможности ее применения для синтезагормона роста.Отдельные порции кДНК, состоящей иэ одной нити, анализируют нанатуральных полиакриламидных гелях.Гели сушат и ДНК, меченную ЗР, анализируют при помощи авторадиографиис использованием пленки Коса 1 с ИозегеепТ. При помощи диаграммыэлектрофореза установлено, чтокДНК представляет собой гетеродисперсоид, После разделения при помощи электрофореза на геле, обнаружена слабая полоса поглощения,соответствующая ДНК с примерно 800парами оснований, что характернодля кДНК, кодирующей гормон роста,П р и м е р 1Полученную кДНК,состоящую из одной нити, обрабатывают обратной транскриптазой сцелью синтеза комплементарной нити,Реакционная смесь содержит50 мМ трис-НСР(рН 8,3); 9 мМ МдСЙ,10 мМ дитиотрейтол; 50 мМ трехнемеченных дезоксирибонуклеози;,триофосфатов, 1 мМ меченного "Р вальфа- позиции нуклеозидтрифосфата судельной радиоактивностью 1."10 Ки/мМ50 мг/мл кДНК и 220 ед, /мл обратной транскриптазы. Реакционнло смесь инкубируют при 45 С в течение 120 мин.1.еакцию прекращают добавлением:ЭДТК-На (до 25 мМ). Смесь экстрагируют фенолом и подвергают хроматографическому анализу на сефадексе С, а затем осаждают этанолом. Порции продукта реакции с показателем от 500 до 100 отсчетов вмин анализируют при помощи электрофреза на геле,Полоса поглощения гетеродисперсоица сосредоточена вокруг 800 нуклеотидов по длине,При обработке полной кДНК, на которой скопирована структура мРНК клетки гипофиза крысы, эндонуклеазой НЬа 1 образуется два основных фрагмента ДНК (установлено при помощи разделения электрофореэом ), причем один содержит примерно 320 нуклеотидов (фрагмент А), а второй. 240 нуклеотидов (фрагмент В),На основе известной последователь-.ности аминокислот ГКР и других из-вестных данных и гормонах роста установлено, что эти фрагменты являютсяв действительности теми частями,на которых, содержится генетическийкод, контролирующий синтез ГРК.При воздействии на кДНК из двухнитей содержащую 800 пар оснований О и выделенную при помощи электрофореза эндонуклеазой Нйа, при анализесреди основных продуктов рассечениябыли обнаруженыдва фрагмента,соответствукнцие по длине фрагментам А и В,г 5 Таким образом, двунитьевую кДНК,содержащую примерно 800 пар оснований, получили с помоцью реакции,катализируемой обратной транскриптазой, содержащей в начале ДНК, имекг щую нуклеотидную последовательность,кодирующую ГРК.Так как кДНК, контролирующую синтез ГРК, содержащую приблизительно800 пар оснований, не очищают перед 25 обработкой эндонуклеазой ограничения, ДНК необходимо подвергнуть обработке с тем чтобы удалить все несоединенные концы. Обработка с цельюудаления таких непарных концовпроизводится перед стадией разделения электрофорезом в смеси, содержащей 25 мл бО мМ тряс-НС ( рН 7,5),8 мМ хлорида магния, 10 мМ ( Ц -мер-,каптоэтанола 1 мМ АТФ и 200 мМкаждого из дАТФ;дТТФ,дГТФ и дЦТФ.Смесьинкубируют с полимераэой 1 ДНК ( 1 ед.),выделенной из штамма Е. со. при10 С в течение 10 мин с тем, чтобыудалить все выступающие 3 -концы изаполнить все 5 -выступающие концы.кДНК, контролирующую синтез ГРКи соцержащую приблизительно 800пар оснований, обрабатывают химически синтезированным линкером Н 1.п 3 Ш.45Полученный в результате реакциипродукт, молекула которого состоит из двух нитей, с концентрацией2-5 мг/мл обрабатывают 30 ед, 8 1= нуклеаэы,имеющей активность 1200 ед/мл, в смеси, содержащей 0,03 М ацетата натрия, (рН 4,6) 0,3 М хлорида натрйя, 4,5 мМ хлорида цинка, при 22 С в течение 30 мин, а затем инкубируют еще в течение 15 мин при 10 С. С целью прекращения ферментной реакции в смесь добавляют трис-основание с конечной19 1205 7 10 15 20 25 30 35 45 50 55 концентрацией 0,1 м ЭДТК до 25 мМ и тРНК, выделенную из Е,со, до 40 мг/мл. После экстрагирования реакционной смеси этанолом и хрома ографического анализа на сефадексе С, меченную Р кДНК элюизхруют в пустой объем и осаждают при помощи этанола. В результате, такой обработки обеспечивается высокий выход молекул кДНК, концы которой связаны основанием.Декамеры Ндпй Н добавляют на каждый конец молекулы кДНК для обеспечения возможности соединения реакционноспособных концов гибридизацией или ковалентной связью кДНК, полученной, расщеплением вектора- переносчика ограничительным ферментом Нпй Ш. Лигация декамера Ндпй Ш с кДНК осуществляется при помощи инкубации при 14 С в смеси 66 мМ трис-НС 1 1 рН 7,6), 6,6 мМ хлорида магния, 1 мМ АТФ, 10 мМ дитиотрейтола, 3 мМ декамера Нпй Ц с показателем 10отсчетов в минуту и лигазы ДНК Т 4, приблизительно 500 ед./мл в течение 1 ч. Для дезактивации лигазы реакционную смесь нагревают до 65 С и выдерживают в течение 5 мин. Предварительно к пищеварительным ферментам, содержащим 150 ед,/мл Нзц 1 или Ндпд Ш, добавляют КСГ с конечной концентрацией 50 мМ, р - меркаптоэтанол с конечной концентрацией 1 мМ и ЭДТК с конечной концентрацией 0,1 мМ; смесь выдерживают в течение 2 ч при 37 С. Эндонуклеазы Нпй Ш и Нао Ш. Продукт реакции анализируют при помощи электрофореза нагеле, при этом был обнаружен пик, соответствующий последовательности приблизительно 850 нуклеотидов наряду с отдельными фрагментами рассеченного декамера Нкпс Ш. Плазмиду рВР, содержащую ген, контролирующий устойчивость к ампицилину, и единственное место узнавания для фермента Нп Ш, расположенное внутри указанного гена, рассекают в месте узнавания для Н 1 нй Ш эндонуклеазой Нзо 1, затем обрабатывают щелочным фосфатом типа РАРГ. Фермент вводят в реакционную смесь с концентрацией 0,1 ед/мл ДНК. Реакционну ) смесь инкубируют в 25 мМ трис-НСЕ при рН 8 в течение 30 мин при 65 С, затем удаляют фос 77 20фатазу путем экстрагирования в феноле.Полученный продукт представляетсобой молекулу ДНК, приготовленнуюрасщеплением вектора-переносчикав данном случае плазмида рВГ)ограничительным ферментом (в данномслучае эндонуклеазой Нпй Ш), Передфосфатазной обработкой расщепленныеконцы вектора-переносчика ДНК, генерированные в реакции расщепленияН 1.пй П, способны соединяться другс другом с помощью гибридизацииили присоединяться к двунитевойкДНК с образованием гибридной иликовалентной связи. После осажденияэтанолом плазмидную ДНК, обработан-ную фосфатазой, добавляют в кДНК,содержащую фермент Ндпй Ш, соединяющий концы молекулы, в молярном соотношении 3 моль плазмиды и 1 молькДНК.Судя по удельной радиоактивности,в реакции применено приблизительно10-50 мг кДНК и 100 мг плазмиднойДНК. Смесь инкубируют в смеси 66 мМтрис-НСГ( рН 7,6), б, б мМ хлоридамагния, 10 мМ дитиотрейтола и 1 мМАТФ в течение 1 ч при 10 С в присутствии 50 ед/мл лигазы ДНК Т 4.Смесь, в которой протекает лигация, добавляют непосредственно всуспензию штамма Е.соа Х, которую для трансформации приготавливают следующим образом,Клетки выращивают до удельной плотности примерно 2 х 10 8 клеток/млв 50 мл среды, содержащей триптон10 г/л, экстракт дрожжей 5 г/л,40 хлорид натрия О г/л, гидрат окисинатрия 2 мМ, диаминопимелиловаякислота О мг/мл и тимин 40 мг/млпри 37 С. Клетки собирают центрифуги рованием в течение 5 мин со скоростью 6000 С при 5 С, вновь суспендируют в 20 мл холодного 10 мМ раствора хлорида натрия, центрифугируют,суспендируют в 20 мл буфера трансформации, сддержащем 75 мМ СаС 1140 мМ хлорида натрия и О мМтрис 1 рН 7,5) , затем смесь выдерживают в течение 5 мин на льду,Клетки центрифугируют и вновь суспендируют в буфере трансформации 0,5 мл.Трансформацию осуществляют путемсмешивания 100 мл суспензии клетокс 50 мл рекомбината ДНК ( мг/мл) .Смесь инкубируют при 0 С в течение21 1 15 мин, затем в течение 4 мин при 25 С и в течение 30 мин при 0 С.Кпетки переносят на питательный агар для роста в селективных условиях. Рекомбинированные,колонии ,селекционируют выращиванием на питательной среде, содержащей ампи" цилин, а если роста не обнаружи 1вается, то на питательной среде содержащей тетрациклин с концентрацией 2 мкг/мл. Получено 10 таких колоний клеток, каждая из которых содержит плазмид с приблизительно 800 парами оснований, молекула которого разрывается под воздействием фермента.пс 1 Ш. Такие вводимые рекомбипатные плазмиды обозначают РГРК. Для дальнейшего анализа выбрали одну колонию рекомбинированных бактерий, обозначенных Е,со 11 Х Х/РГРК. Из культуры Е.со 1 Х/РГРКприготовили плазмиду ДНК, обозначенную РГРК.ДНК гормона роста крысы, содержащую 800 пар оснований, выделяют в препаративных количествах 5-30 мг из рекомбинированного клока РГРКпутем расщепления Н 1.пй Ш эндонуклеазой и анализируют .последовательность нуклеотидов. Нуклеотидная последовательность содержит участки 5 областей, которые не участвовали в трансляции, а также последовательность 26 аминокислот, которые были обнаружены в протеине, предшествующем гормону роста, перед стадиеи выделения.Таким образом, приблизительно 800 пар оснований выделены из плазмиды РГРК, закодированной для гормона роста и представляющей собой вектор-переносчик ДНК, имеющий нуклеотидную последовательность, кодирующую гормон роста.П р и м е р 2, Выделение мРНК, контролирующей синтез ГРЧ, проводят аналогично примеру 1, однако биологическим источником материала является ткань гипофиза человека., Пять доброкачественных гипофизов человека, замороженных в жидком азоте после хирургического удаления, вес которых 0,4 - 1,5 г каждый, оттаивают и тонко измельчают в 4 М растворе гуанидинтиоционата, содержащем 1 М буферный раствор Р -меркаптоэтанолаРН 5,01 при 4 С. Гомогенат наслаивают на 1,2 мл 5,7 М раст 20577722вора хлорида цэзия, содержащего100 мМ ЭДТК и центрифигируют в течение 18 ч со скоростью 37000 об/мин на ультра-центрифуге Бекман с ротором типа БЮ 50,1. При этом РНК собирается на дне пробирки. Далее, проводится очистка с использованием колонны на олиго-дТ осаждение при помощи градиентного раствора цукро 4роста человека. Первые 23 аминокислоты гормона роста имеют вид: НЫ-РЬе-Руо-ТйгТе-Рго-Ьец-Бег-Агц-Ьецсо 55 2 О 25 ЗО зы. Примерно 10% выделенной такимобразом РНК содержит генетический код для синтеза гормона роста, чтоустановлено путем введения радиоактивного соединения, содержащегоаминокислоты в гормон, подавляющий;рост, который выпадает в осадок всистеме клеток, в которых не проис -ходила трансляция и полученных иззародышей пшеницы, кДНК гормона роста человека получают аналогично примеру 1. кДНК гормона роста фракционируют при помощи электрофорезана геле и материал с примерно 800нуклеотидами по длине выбирают дляразмножения. Выбранную фракцию обрабатывают полимеразой 1 ДНК согласно примеру 1, затем обрабатываютлинкером Нпй 111 с целью сцепленияконцов. Далее кДНК рекомбинируетсяс плазмидой РВР, обработаннойщелочной Фосфатазой в присутствиилигазы ДНК. Клетки штамма Е. со 1 Хтрансформируют рекомбинантомДНК, а затем штамм содержащий ДНКгормона роста, извлекают. Штамм,содержащий ДНК гормона роста, выращивают в препаративных количествах,иэ него выделяют ДНК гормона роста,а затем определяют последовательность нуклеодидов. Было установлено,что выделенная ДНК гормона ростасодержит нуклеотиды, содержащие информацию для синтеза полной последовательности аминокислот гормона Рйе-Азр-Азп-А 1 а-МеС-Ьец-Аг 1-А 1 а-НзАг д-Ьеы-Нх з -С 1 ц-Ьеи,Нуклеотидная последовательность одной нити ДНК гормона роста человека,а также последовательность ДНК,которая соответствует последовательностимРНК, контролирующей синтез ГРЧ (исключение составляет то.,что вмРНК Ч заменяет Т),. показаны ниже. Числа относятся к последовательности кислот ГРЧ,начиная с конечной аминогруппы, 23 1205777нм РЛод оФ оинс ц4ц ой оО Оэнь 0 Нм Ооо ииь он Цци ОО Оа оаОщц бС Оц44 ОнфЯоис оБ бэ Рн Нн 4Яоиф й444 Р4 Е н ф 4 3 иД р и Д Л а ф Л нм о.н Л 4 и4 и 4 Ч э онф нНф нч цООН 4ф оо4 Ос н44С О4ц оЮ Н4 Ннм ое ои нн нъ ф 4м им цоС ОиОн оО Ос иО Оо ооцэ ню 4 Нниноео ни ОцО4ц це цОю нС О ц Р О а и М б о ф ц 4 О ф о з о Д о и ф О Я й о н ф о ц о нц ю Н.4 м ннц ч) м и О Й о о м и ь о 44 О в н ф о и . ц о н н ц оз нс ц О м н н н о ф ,м оО с ц а ДО О 44 О х э 8 с цо ОО О ь о м 8о ,:1 иц О44 О бн о о Р о .4 О н ц О в Я й Й ДОмоОа олс Оос оаоа оС Н 4Ов оом ов оШа ЙРО д це д нОн ии Йм о445 Ьй нцн цОс оды ин О44 ЦУ.с о4ф он ца оО о о о о о и ц о о1205777 Т ТС 6 он 5 ссддксгге Ео СбАА СС ддсгкда (д) с Ю 4 сО ТР ДЯ77 СС Составитель Т. Полянскаяелинская Техред И.Асталош Корректор И, Зрдей то Заказ 8551/62 ая наб д. 4/ иал ППП "Патент", г, Ужгород ул. Проектная, 4 3 у 93 НЖА Тираж 490 НИИПИ Государственного к по делам изобретений и 13035, Москва, ЖРауИзобретение относится к способам получения ДНК-переносчика, имеющего нуклеотидную последовательность, кодирующую гормон роста.Последовательность оснований ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) хранит генетическую информацию, и исполь эуется в качестве кода, в соответствии с которым клетка синтезирует последовательность аминокислот всех протеинов. Некоторые части этой последовательности являются регуляторами, контролирующими время и количество синтеэируемых протеинов (природа этих контролирующих элементов исследована только частично). Кроме тоги последовательность осно ваний в каждой нити используется в качестве шаблона для репликации ДНК, которая осуществляется при делении клетки. Процесс, при помощи которого несущая генетическую информацию последовательность оснований в ДНК используется для образования последовательности аминокислот протеинов,в самых общих чертах является универсальным для всех живых организмов. Установлено, что каждая аминокислота, содержащаяся в протеинах, определяется одним или несколькими тринуклеотидами или последовательностями триплетов, Для каждого протеина суще ствует соответствукщий сегмент ДНК, содержащий последовательность триплетов, соответствующих протеиновой последовательности аминокислот. Генетический код представлен в таблице.В биологическом процессе преобразования информации, содержащейся в последовательности нуклеотидов, в структуре последовательности аминокислот на первой стадии осуществляется транскрипция. На этой стадии локальный сегмент ДНК, содержащий последовательность, которая относится к определенному протеину, копируется на РНК ( рибонуклеиновой кислоте). РНК является полинуклеотидом, аналогичным ДНК, но вместо рибо" зы здесь содержится дезоксирибоза, а вместо тимина используется урацил.оПары оснований в РНК могут быть взаимосвязаны также как и в ДНК. Таким образом, в результате транскрипции РНК последовательности нуклеотидов из ДНК РНК становится 10 5 20 25 30 35 4 О Я комплементарной по отношению к после" дующему копированию. Такая РНК назы вается матричной РНК (мРНК) из-эа ее промежуточного положения между генетическим аппаратом и аппаратом синтеза протеина клетки.Внутри клетки мРНК происходит сложный процесс, в котором участвуют различные ферменты и органеллы внутри клетки, в результате которого синтезируется определенная последовательность аминокислот. Этот процесс называется трансляцией мРНК. В результате дополнительной обработ,- ки последовательность аминокислот, синтезированная в течение процесса трансляции, превращается в функциональный протеин.Многие протеины, имеющие важное значение в медицине, в частности гормон роста, протеины, участвующие в механизме регулирования кровяного давления, а также большое количество других ферментов, обнаружены в клетках или вырабатываются клетками высших организмов, например позвоночных. Однако получить их в необходимом количестве экстрагированием иэ организма, особенно из организма человека, очень трудно. Поэтому возникает необходимость в получении протеинов иэ искусственно выращенных клеток. Применение лзвестных, способов выращивания биологической ткани нецелесообразно, поскольку клетки растут медленно, наблюдается их низкий выход, используется дорогостоящая среда для выращивания и условия выращивания необходимо жестко контролиро-, вать. Кроме того, как правило трудно подцерживать такие условия выращивания клеток, чтобы добиться искомых свойств деления. Мик оорганиэмы, например, бактерии, относительно просто выращивать в среде, обладающей определенными химическими свойствами. Современная технология процессов ферментации в достаточной степени развита и хорошо поддается контролю. Микроорганизмы быстро размножаются, что обеспечивает их высокий выход. Кроме того, некоторые микроорганизмы достаточно хорошо исследованы с генетической точки зрения.Таким образом, необходимо найти переносчика генетического кода про теина, представляющего медицинскуюценность, из организма, который вырабатывает протеин, в нормальныхусловиях в подходящий микроорганизм.В этом случае протеин синтезируется микроорганизмами при контролируе-,мых условиях роста и в необходимыхколичествах. Предлагаемый способпозволяет значительно снизить общуюстоимость получения искомого протеина и обеспечивает, воэможностьвьщеления и транспортирования генетической последовательности, которая программирует получение определенного протеина в микроорганизме, имеющего вполне определеннуюгенетическую структуру, а такжеисследования механизма синтеза такого протеина в контролируемых условиях и механизма дальнейшей обработ 1ки протеина после стадии синтеза.Кроме того, выделенные генетическиепоследовательности можно модифицировать с целью получения генетического кода для синтеза других протеинов, имеющих другие терапевтическиеили функциональные свойства.Цель изобретения - получениевектора, имеющего нуклеотидную последовательность, кодирующую гормонроста, путем вьщеления молекулы ДНКспеци пьной последовательности нуклеотида и ее транспортировки в микроорганизм а также обнаружения исход 7ной последовательности нуклеотидовДНК после репликации в указанноморганизме.Предлагаемый способ состоит иэчетырех основных стадий,1. Вьщеление искомой популяции, клетки из высшего организма.Имеется два потенциальных источ.ника последовательности, несущейгенетический код для синтеза протеина: сама ДНК организма-источника иРНК, полученная после транскрипциина матрице ДНК. Мерами безопасности предусмотрено введение геновчеловека в рекомбинированную ДНК изатем в клетку бактерии только послеих тщательного отбора при помощиспециального оборудования, предназ-наченного для экспериментов, связан.ных с большой степенью риска ( Р 4),В большинстве тканей желез илидругих органов клетки связаны между собой слоистой сетью соединительных тканей, которые состоят в основ 205777 10 15 20 Например,при отделении мРНК гормонароста крысы (ГРК) обработка выращиваемых клеток гипофиаа крысы тироидным гормоном и глюкокортикоидамизначительно увеличивает количествомРНК гормона роста.П, Вьщеление мРНК. Применениепредлагаемого способа позволяетполностью вьщелить активную РНКиз экстракта клеток.Выделяемая мРНК является однойполинуклеотидной нитью, не имеющей пары среди других комплементарных нитейСледовательно, гидролитическое рассечение одной фосфодиэфирной связи в последовательности может привести к образованиюполной молекулы, которая непригодна для транспортировки полной генетической последовательности в микро"организм. Широко распространенный,очень активный и исключительноустойчивый фермент РНК-азы находится на поверхности, обнаруживаетсяпри помощи известных способов промывки и иногда загрязняет используемые химические материалы, чтоособенно нежелательно при работес экстрактами клеток поджелудочнойжелезы, так как поджелудочная железа является источником пищеварительных ферментов и поэтому богата РНКазой. Однако проблема загрязненияРНК-азой актуальнаи при работе с другими тканями.Предлагаемый способ подавленияактивности РНК-азы применим к любым тканям, однако наиболее эффективен 25 30 35 40 45 50 55 Ф ном из коллагена, но могут содержать в зависимости от ткани и другие структурные протеины, полисахариды и минеральные отложения, При вьщелении клеток иэ соединительной тКани необходимы специальные средства.Таким образом, выделение и очистка типа клеток заключает в.себе две основные стадии: высвобождение кле- ток иэ матрицы соединительной ткани и отделение клеток искомого типа от всех клеток других типов, которые содержатся в ткани.Содержание искомой мРНКможно увеличить используя способность клетки реагировать на внешние возмущения, например обработку популяции клетки гормоном, определенную темпе-, ратуру и использование специальных питательных или других химических веществ.1205777 10 при выделении полной мРНК из отделенного участка ткани поджелудочной железы.Согласно предлагаемому способуиспользуются хаостропный анион,5хаостропный катион и разрывающийдисульфидные связи агент как приразрушении клетки, так и в течениевсех операций, которые необходимыдля вьщеления свободной РНК иэпротеина. Эффективность комбинированного действия укаэанных агентовбыла доказана при их использованиидля вьщеления полной мРНК с хорошимвыходом из участков Лангерханса 15поджелудочной железы крысы.Выбор соответствующих хаостропных ионов зависит от их растворимости в водных средах. К хаостропным катионам относятся гуанидин,карбомоил-, гуанилгуанидин, литийи т.д.; к хаостропным анионам -иодид, перхлорат, тиоцианат, дийодосалицинат и т.п. Относительнаяэффективность солей, образованных 25комбинированием таких катионов ианионов, частично определяется ихрастворимостью, . Например, дийодосалицинат лития обладает более сильным денатурирующим свойством, чемгуанидинтиоцианат, но его растворимость составляет всего 0,1 И и,кроме того, он является относительно дорогостоящим материалом. Предпочтительно используют комбинациюкатион-анион, так как она легкодоступна и хорошо растворяется в водныхсредах до 5 И.Тиоловые соединения, такие какР-меркаптоэтанол,дитиотрейтол,цйстеин, пропанолдимеркаптан, исполь"зуются для разрыва внутримолекулярных дисульфидных связей в протеинах при помощи тиолдисульфиднойреакции обмена, Наиболее предпочтительно применение Я -меркаптоэтанола, поскольку он легкодоступен иимеет невысокую стоимостьрастворяться в воде, так как для доведенияобменной реакции до конца необходимо,чтобы тиоловое соединение было вбольшом избытке по сравнению с,внутримолекулярными дисульфидами. Эффективность хаос)гропного агента непосредственно зависит и от его 55 концентрации; предпочтительно используется максимально возможная концентрация. ЬНа выход неповрежденной мРНК настадии выделения влияет скорость,с которой денатурируется РНК-аэа,а также масштаб процесса денатурации.Поэтому преимущественно используютгуанидинтиоцианат по сравнению сгидрохлоридом, несмотря на то, чтоактивность гидрохлорида в качестведенатурирующего агента лишь незначительно отличается от активноститиоцианата. Эффективность денатурирующего агента определяется пороговой концентрацией, которая необходима для достижения полной денатурации протеина, скорость которой зависит от концентрации денатурирующегоагента относительно порогового значения, иэменяюп 1 егося, от 5 до 10-йстепени. Поэтому денатурирующеесредство, незначительно более сильное, чем гуанидингидрохлорид,может денатурировать протеин в несколько раз быстрее при той же концентрации.Анализ показал, что целесообразно использовать денатурирующеесредство с низким пороговым значением денатурирующей концентрациии высокой растворимостью в воднойсреде. Исходя из этого целесообраз-.нее применять гуанидинтиоционат,а не дийодсалицилат лития, хотяпоследний обладает более сильнымденатурирующим действием ( растворимость гуанидинтиоционата намноговыше, поэтому его можно использовать в концентрациях, при которыхгораздо быстрее подавляется активность РНК-азы). Кроме того, гуанидинтиоционат по сравнению с гидрохлоридной солью, имеющей сравнимуюстепень растворимости, обладает несколько большей динатурирующейспособностью,Использование агента для разрыва дисульфидной связи в комбинации с денатурирующим средством увеличивает эффективность последнего, обеспечивая получение полностью развернутой молекулы РНК- азы. Если некоторое количество РНК-азы остается в качестве примеси в процессе получения мРНК, она неактивна даже при отсутствии денатурирующего средства и тиола. Агенты для разрыва дисульфидных связей содержащие тиоловые группы, эффек-, тивны при любой концентрации, обес5 25 35 45 В некоторых случаях, напримеркогда в качестве источника мРНКиспользуются клетки ткани с достаточно низким содержанием РНК-азы,для снижения активности РНК-азы 55могут применяться известные способы,111. Образование кДНК (комплементарной ДНК),7 205 печивающей рассечение внутримолеку. лярных дисульфидных связей. Однако верхний предел концентрации ограничен тем, что соединения при высоких концентрациях зловонны. Уста ;новлено, что оптимальной концентра-, цией Р -меркаптоэтанола является 0,05-1,0 М, а для выделения полной РНК из поджелудочной железы крысы концентрация составляет О, 2 М. ОВеличина рН среды в процессеэкстрагирования мРНК из клеток может составлять 5,0 - 8,0.После стадии разрушения клетки РНК выделяется из основной массы протеина клетки и ДНК известными способами, например осаждением из этанола, в соответствии с которым РНК селективно осаждается в осадок. В соответствии с предлагаемым спо собом эту стадию можно исключить, при этом гомогенат вводят в раствор 5,7 М хлорида цезия, находящийся в камере центрифуги, что обеспечивает высокий выход РНК, свободной от ДНК и протеина.В результате осуществления всех описанных выше стадий из гомогената клеток выделяется полная ГНК. Однако только часть этой РНК является искомой мРНК, Для извлеченця искомой мРНК используется способность мРНК в клетках высших организмов после транскрипции присоединять полиадениловую кислоту. Такая мРНК, содержашая последовательность полиЛ (аденин) которые присоединены к ней, может быть селективно выделена при помощи хроматографии на колоннах, содер 40 ,жащих целлюлозу с присоединением олиготимидилата. Выполнение всех описанных выше стадий достаточно для получения из источников, богатых РНК-азой, существенно чистой, полной, пригодной для копирования (трансляции) мРНК. Очистка мРНК и ,последующие лабораторные стадии могут быть осуществлены из клеток любого организма.50 777На чертеже схематически представлены оставшиеся стадии предлагаемогоспособа,Первая стадия. Образование последовательности ДНК, комплементарнойк выделенной мРНК.В качестве фермента для даннойреакции выбрана обратная транскриптиза, хотя можно использовать любойдругой фермент, способный образовывать точную копию нити к ДНК, используя мРНК в качестве шаблона.Эта реакция протекает при известныхусловиях с использованием мРНК вкачестве шаблона . и смеси четырехдезоксинуклеоэидтрифосфатов в качестве предшествующих соединенийдля ДНК из одной нити, Для того,чтобы можно было следить за течениемреакции, один иэ дезоксинуклеозидовтрифосфатов метят при помощи Р вальфа-позиции; метку можно использовать и в качестве ориентира дляизвлечения продукта после стадииотделения, например, при хроматографии и электрофорезе, а также припроведении количественных оценокна стадии извлечения.Как показано на чертеже, продуктом реакции с обратной транскриптазой является структура из двухнитей, имеющая форму приколки дляволос, с нековалентной связью междунитью РНК и нитью ДНК.Продукт реакции с обратной транскриптазой получают из реакционнойсмеси путем, например. Экстрагирования из фенола, хроматографии насефадексе Си осаждения из этано"ла.После синтеза кДНК в результатеферментной реакции шаблон РНК можноудалить. Селекторное разрушение РНКв присутствии ДНК, по предлагаемому способу осуществляют щелочнымгидролизом с высокой избирательностьюи возможностью регулирования, обеспечивания необходимое эначени е величины рН.После щелочного гидролиэа и последующей нейтрализации, если это необходимо, кДНК, меченная Р, можетбыть сконцентрирована путем осаждения этанолом,Синтез имеющей форму приколки для волос молекулы кДНК иэ двух нитей достигается при помощи соответствующего фермента, такого как ДНК12057 полимераза или обратная транскриптаза, Реакционные условия аналогичныусловиям, которые использовалисьранее, включая использование меченного с 1. - Р нуклеозидфосфата. Обратную транскриптазу можно получить,например, из вируса ач 1 ап ща 11 оЬ 1 аягоядя,После образования молекулы кДНК,имеющей форму приколки для волос,ДНК извлекают из реакционной смесипутем экстрагирования из фенолахроматографии на сефадексе Сиосаждения из этанола: при этом ДНКочищается от загрязняющего протеина,Молекулу. ДНК в форме приколкидля волос можно превратить в болеепредпочтительную структуру ДНК иэдвух нитей при помощи удаления петли из одной нити, соединяющей концы комплементарных нитей, Для этого проводят обработку ферментами,пригодными для гидролитического рассечения фрагментов ДНК, содержащиходну нить, например 81-нуклеазой,выделенной из Аярегц 111 ця огукае,в результате чего получают высокийвыход молекул кДНК, концы которыхсоединены основанием. Затем осуществляют экстрагирование, хроматографию и осаждение из этанола.При необходимости доля молекулкДНК, имеющих срез анные концы, можетбыть увеличена при помощи обработкиДНК полимеразой, которая выделяетсяиз микроорганизмов Е.со 11 в присутствии четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, Комбинированное действиеферментов эндонуклеазы и полимеразыприводит к удалению любого выступающего 3 -конца и к заполнению люЭбого выступающего 5 -конца. Приэтом обеспечивается участие максимальной доли молекул кДНК в последующих реакциях с лигазами,Затем осуществляют обработкуконцов кДНК с тем, чтобы обеспечитьсоответствующие последовательностина калдом конце, содержащие места,узнавания для эндонуклеаэы ограниченияВыбор участка ДНК, которыйприсоединяется к концам, определяется материалами, с которьри пред-,стоит манипулироватьПоследовательность, которую присоединяют к концам, выбирают в зависимости от выбранного фермента эндонуклеазы ограничения, который,в свою очередь,О2035405055 7,7 1 Озависит от переносчика ДНК, с которым кДНК рекомбинирует. Выбранныйпри этом плаэмид должен иметь покрайней мере одно звено, по которому происходит рассечение при обработке эндонуклеазой ограничения, Например, плаэмид рМВЭ содержит одну точку ограничения для фермента Н 1 пп ,Фермент Н 1 пс 1 Ш выделяют из бактерийНешорЬ 11 ця 1 пй 1 цепкае и очищают( Смит Х,О., Уилкоксом К,В. 1. Мо 1.Вдо 1, 1970, 51/379). Фермент Нае Шполучают из Непюрй 11 ця аедург 1 опяи очищают ( Миддлтон Дж.Х., Эдгелем М,Н., Хатчисоном Ш, С.А. - 3.ч 1 го 1, 1972, 10, 42). Фермент,полученный из Нешор 11 ця яц 1 я, названный Чяц 1, катализирует гидролизтех же мест узнавания, что и ферментН 1 пй 111. Следовательно эти два фермента могут заменять друг друга.С целью присоединения к концамдвойной кДНК предпочтительно использовать химически синтезированныйдекануклеотид из двух нитей, содержащий последовательность мест узнавания для фермента Н 1 по Ш. Известныразличные синтетические последовательностии мест узнавания, поэтому можнополучить концы двойной ДНК, восприимчивые к действию любой из эндлну-клеаз ограничения.Присоединение последовательностимест узнавания к концам кДНК осуществляют известными методами. Выборосуществляют на основе реакции, которая завершается лигацией срезанныхконцов, которая каталиэируется лигазой ДНК, очищенной по известномуспособуПанет А. и др, В 1 осЬеадягу 1973, 12,5045 ),Продуктом реакции лигации срезанных концов между кДНК со срезаннымиФ. концами и большим молярным избыткомдекануклеотида из двух нитей, содержащего в качестве эндонуклеазы мест уэна.вания фермент Ндпс 1 Ш, является кДНК,содержащая на каждом конце последовательность мест узнавания ферментаЫпй 1 В. Обработка продукта реакции1эндонуклеазой Нпс Ш приводит крассечению молекулы в месте узнавания с образованием самокомплементарных молекул, состоящих иэ одной нити с концами 5 (см. чертеж).Я, Образование переносчика рекомбинированной ДНК.С целью образования рекомбинатовс кДНК можно использовать разныежизнеспособные плаэмиды ДНК,Основные требования заключаются в том, чтобы переносчик ДНК мог проникать в клетку-хозяина, подвергаться в ней репликации и содержать генетическийдетерминант, при помощи которого можно было бы выбрать те клетки которые получили указанный переносчик. В качестве соответствующихпереносчиков предпочтительно используют, в частности производные бактериофагов лямбда и производные плазмиды со 1 Е 1.Плазмиды, полученные из со 1 Е 1, имеют молекулы относительно небольшого размера, молекулярный вес по-:рядка нескольких миллионов и, крометого, обладают тем свойством, чточисло копий плаэмид ДНК на одну клетку-хозяина может быть увеличеноот 20-40 при нормальных условияхдо 1000 и более при обработке этихклеток хлорамфениколом. Способностьплазмид распространять генетическиефакторы внутри клетки-хозяина обеспечивает возможность при соответствующих условиях, контролируемых исследователем, заставить клеткухозяина вырабатывать протеины, генетический код на синтез которыхбыл перенесен плазмидой. Такимобраз:м, целесообразно, в качествепереносчика ДНК испольэовать производные, выделенные из со 1 Е 1, вчастности плазмиды рМВ, несущиеген, контролирующий устойчивостьк тетрациклину, а также рВР,рВР, рВР, рВРи рВР,которые несут ген., контролирующий густойчивость к амплицилину. Наличиегенов, контропирующих устойчивостьк лекарственным препаратам, позво-,ляет селекционировать клетки, которые содержат плазмиды, так как популяции таких клеток выращивают в присутствии лекарственных препаратов. Клетки, которые не содержат плазмид, не имеют воэможности расти или образовывать популяции. Согласно предлагаемому способу используют плазмиды, выделенные иэ со 1, Е 1, содержащие, одно. место узнавания для Фермента Нык 1 Ш.Рекомбчнированные плазмиды образуются в результате смешения плазмиды ДНК, обработанной эндонуклеазой ограничения, с кДНК, содержащей концевые группы после аналогичной обработки, Для сведения к минимумуО 15 20 45 50 55 25 30 35 40 вероятности образования комбинации сег. ментов кДНК друг с другом плазмиду ДЛК добавляют в молярном избытке по сравнению с кДНК. Это относится к большинству плазмид, которые исполь. зуются без введенного фрагмента кДНК. Следовательно, трансформированные клетки не содержат рекомбинированных плазмид кДНК. Поэтому процесс селекции является очень трудоемким и продолжительным. Попытки синтезировать носители ДНК, содержащие места для действия эндонуклеазы ограничения, в середине соответствующего гена, так, чтобы введение рекомбината способствовало разделению гена,привели к снижению функции гена какносителя информации, Предпочтитель.но используют способ для снижения числа колоний, к которым затем применяют рекомбинированную плаэмиду, согласно которому отрезки плаэмиды ДНК обрабатывают эндонуклеазой ограничения и щелочной фосфатаэой, вследствие, чего удаляются 5 -терминальные фосфаты, находящиеся на концах, образовавшихся в результате действия эндонуклеазы, и предотвращается самолигация плазмиды ДНК.Следовательно, образование цикла, а значит и трансформация, зависит от введения в молекулу фрагмента ДНК, содержащего фосфорированные 5 -терминалы. Этот способ снижает относительную частоту трансформации при отсутствии рекомбинации до ме нее 10;Предлагаемый способ основан на реакции, катализатором которой служит лигаэа ДНК, между 5-концевой фосфатной и 3 -концевой гидроксильной группами ДНК, Если терминальный 5 - Фосфат отсутствует, то реакция не осуществляется. Соединение ДНК из двух нитей представлено в таблице (концевые группы отмечены гидроксилом ( ОН) или Фосфатом(ОРОГО Н) .В первом случае 5-фосфаты находятся на обоих концах реагента, в результате чего между двумя нитями установлена ковалентная связь. Во втором случае только одна из нитей, вступающих в связь, содержиттерминальный 5 - фосфат, в результате чего между одной парой нитей установлена ковалентная связь, тогда как на другой нити разрыв сохра13 1205717 Схема реакции между 5 -концевой фосфатной и 3 -концевой гидроксильной группами ДНК, катапизируемой лигазойСлучай Реагенты Лигаза 3 3 Н,О, РОВ Ъ ЭЕЖРШШР вФ О э О ОРОСИ Н ОН О + Р, О +2 Р 3 3 1 5.ОН ОН ОН ОН ОН Нет реакции няется. Нить, не содержащая ковалентной связи, остается связаннойсо всей молекулой благодаря связывающему взаимодействию между атомамиводорода комплементарных пар основанийна противоположных нитях, Втретьем случае ни один из концов несодержит 5 - фосфата и реакция соецинения отсутствует. Таким образом, нежелательныхреакций соединения можно избежать,обработав соответствующие концы молекулы реагента с целью удаления5 -осфатных групп любым известнымспособом не разрушающим структуруДНК, в ;астности гидролизом, катализируемым Ферментом - щелочной фосфатазой,Аналогичным способом выделяетсякДНК, содержащая генетический код для синтеза ГРК, рекомбинируется сппазмидой и транспортируется вЕ.со 11 После продолжительной репликации в Е,со 1 выделяется последовательность нуклеотидов, содержащая приблизительно 800 нуклеотидов по длине. Было установленочто она содержит полную последовательность, содержащую гене,ический 16 код для синтеза ГРК, а также некоторые части предшествующих пептидови часть 5 - области, которая неучаствовала в трансляции.Предлагаемый способ можно использовать для выделения и очистки генов высшего организма, включая генычеловека, а также транспортировкиих в микроорганизм для репликаций.В таблице приведены конкретные 20 примеры выполнения предлагаемогоспособа.5О15 20 25 30 35 40 45 50 55 Культивированные клетки гипофиза крысы (подклон семейства клетокСН) использовали в качестве источника мРНК для синтеза ГКР. Вэтих клетках, если рост происходитв нормальных условиях, мРНК гормонароста содержится в небольших количествах 1 - 37 от общего содержания РНК, имеющей полиА. Однако,содержание мРНК гормона роста значительно увеличивается в результатестимулирующего действия тироидныхгормонов и глюкокортикоидов. РНКвыделяется из 510 клеток, выращиваемых в суспензии, в которую с .целью получения гормона роста за4 дня до сбора клеток добавляют1 мМ дексаметазона и 10 мМ Е-трийодтиронина, ПолиаденилированнаяРНК выделяется из цитоплазменныхразделяющих мембран культивируемыхклеток известными способами, Полиаденилированная РНК, выделенная изгипофизных клеток, содержит мРНК,кодирующую гормон роста. Клетки делают более вязкими обработкойтрипсина и обрабатывают ледяным25 мМ раствором фосфата калия и0,1 11 ИаСЙ при рН 7,4. Затем клеткиинкубируют 10 мин при 0 С в 10 мМИаСЕ 1 О мМ Теизм -НС 2 р 8,5 и,3 мМ МяС 1, 5 мп/г клеток. Далее.клетки разрушают в гомогенизатореФДоунса. Ядра удаляют центрифугированием гомогената при 800 С в течение 5 мин. Супернатант изготовляютиэ 0,5% вес/об,) додецилсульфатанатрия (НДС ), 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК) и 100 мММаС 2. РНК экстрагируют фенолхлороформом и осаждают 25 объемами этанола. Таблетку РНК, полученную центрифугированием осадка при 10000 Св течение 20 мин, растворяют в водном растворе, содержащем 0,57(вес/об.) НДС, 5 мМ аСГ и 1 мМ ЭДТК,после чего инкубируют в течение30 мин при 37 С вместе с 100 мг/млсамопереваренной проназы. Из инкубированной смеси РНК повторно экстрагируют фенолхлороформом и осаждаютэтанолом, после чего растворяют вводе до концентрации в 2 мг/мп ихранят при -60"С,1Получают 10 клеток - 1 О мг цитоплазмовой РНК, включая рибосомнуюРНК и РНК-переносчик, в дополнениек полиаденилированной РНК. Полиаденилированную РНК выделяютпри помощи хром а тогр афиче с ко го анал иза всего препарата РНК на олиго-(дТ/целлюлозе, Выход 30 мг из 5 х 10клеток,Синтез двунитьевой кДНК (гдеодна нить имела нуклеотидную последовательность, комплементарнуюмРНК)завершают реакцией, катализируемойобратной транскриптазой,содержащейсмесь деэоксиаденозинтрифосфат(дАТФ,дезоксицитидинтрифосфат (дЦТФ) дезоксигуанозинтрифосфат (дГТФ),дезок,ситимидинтрифосфат (дТТФ ), выделенную как описано выше мРНК, олиго-,дТ-я -целлюлозу Бцрга и обратнуютранскриптазу.,Обратную транскриптаэу, выделеннуюиз вируса ач 1 ап шас 1 оЪ 1 аяТоя 1 я,используют для того, чтобы скопировать полную молекулу полиаденилированной РНК, полученную из участков Лангерханса крысы, на кДНК. Реакции осуществляют в растворе 50 мМ трис- НСГ (рН 8,3), 9 мМ М 8 СУ, 30 мМ хлорида натрия, 20 мМ ф-меркаптоэтанола,мМ каждого из трех нерадиоактивных дезоксирибунуклеоэидтрифосфатов, 250 мМ четвертого дезоксинуклеозидтриофосфата, меченного Р в альфаз позиции, с удельной радиоактивностью 50-200 Ки/моль, 20 мг/мл олиго-дТ. 100 мг/мл полиаденилированной РНК и 200 ед./мл обратной транскриптазы. Смесь инкубируют при 45 С в течение 50 мин. После добавления 45 мМ . ЭДТК-)а раствор экстрагируют насыщенным водой фенолом, водяной слой хроматографируют на сефадексе Сс колонкой диаметром 0,3 см и высотой 10 см в смеси 10 мМ трис- НС Р. (р 9,0), 100 мМ хлорида натрия, ф 2 мМ ЭДТК. Нуклеиновую кислоту, элюированную в пустой объем, осаждают этанолом после добавления ацетата аммония, до 0,25 М ( рН 6,0) . Осадок собирают центрифугированием. Полученный осадок растворяют в 50 мл свежеприготбвленного 0,1 М раство- . ра гидрата окиси натрия и инкуби-. руют при 70 С в течение 20 мин с целью гидролиза РНК. Смесь нейтрализуют добавлением 1 М раствора ацетата натрия ( рП 4,5), а меченнуюР кДНК осаждают этанолом, а затем вновь растворяют в водеОбразовавшийся промежуточный продукт представляет собой однонитевую кДНК,